siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Summary

Her beskriver vi en metode for å utføre en målrettet siRNA "ubiquitome" skjermen for å identifisere romanen ubiquitin og ubiquitin-lignende regulatorer av HIF1A-mediert cellulær respons på hypoksi. Dette kan tilpasses til en hvilken som helst biologisk vei, hvor et robust lest ut av reporter-aktivitet er tilgjengelig.

Abstract

Post-translasjonell modifisering av proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) fremstår som en dynamisk cellulære signaler nettverk som regulerer ulike biologiske mekanismer inkludert hypoksi respons, proteostasis, DNA skade respons og transkripsjon. For bedre å forstå hvordan UBLs regulere trasé som er relevante for menneskelig sykdom, har vi satt sammen en menneskelig siRNA "ubiquitome" bibliotek bestående av 1186 siRNA duplex bassenger rettet mot alle kjente og spådd komponenter av UBL system trasé. Dette biblioteket kan være skjermet mot en rekke cellelinjer som uttrykker journalister av ulike biologiske mekanismer for å avgjøre hvilken UBL komponenter fungerer som positive eller negative regulatorer av veien i spørsmålet. Her beskriver vi en protokoll utnytte dette biblioteket for å identifisere ubiquitome-regulatorer av HIF1A-mediert cellulær respons på hypoksi ved hjelp av en transkripsjon basert luciferase reporter. En innledende analyse utviklingsfaseer utført for å etablere egnede rastreringsparametre av cellelinjen før utførelse av skjermen i tre trinn: primær, sekundær og tertiær / deconvolution screening. Bruken av målrettet enn hele genomet siRNA bibliotekene blir stadig mer populært som det har fordelen av å rapportere bare på medlemmer av veien som etterforskerne er mest interessert. Til tross for iboende begrensninger siRNA screening, spesielt falske positiver forårsaket av siRNA off-target effekter, identifisering av ekte nye regulatorer av trasé i spørsmålet oppveier disse svakhetene, som kan overvinnes ved å utføre en rekke nøye gjennomført kontrolleksperimenter.

Introduction

Modifisering av proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) representerer en ekspansiv biokjemisk system som regulerer ulike biologiske mekanismer og stressresponser. Den kovalente binding av UBLs til sine mål-proteinene kan ha ulike resultater som regulerer stabilitet, lokalisering, funksjon eller interactome av substratet ^1.. Den enzymatiske trinn underliggende UBL endring, ble først etablert for ubiquitin, og nå tjene som et paradigme for modifisering med de fleste UBLs, inkludert SUMO, NEDD8, ISG15 og FAT10. For modifisering å oppstå, er karboksylat-gruppe på det UBL diglycine motivet først aktiveres av en E1 aktiverende enzym for å danne en høy-energi-tiol som er overført til det aktive stedet for cystein i en E2 conjugating enzym. Den E2 samhandler med et substrat-bundet E3 ligase til å mediere transport av UBL bort (vanligvis) et mål lysinresten skape en forgrenet kjede (isopeptide) binding ². Suksessive runder med modifikasjon kan forekomme for å bygge isopeptide kjeder på substratet, som for ubiquitin kan skje ved en hvilken som helst av dens syv lysines, eller gjennom dens N-terminale metionin for å lage lineære ubiquitin-kjeder. Disse endringene danner diskrete topologier med ulike formål som å opprette nye samhandlings motiver og målretting proteiner for degradering før UBL fjerning av spesialist proteaser. I tilfelle av ubiquitin det to E1 enzymer, 30-40 E2 konjugering av enzymer, i det minste 600 E3 ligaser og omtrent 100 deubiquitylating enzymer (DUBS). Mens banene er mindre ekspansiv for de andre 10 eller så UBLs, gir den generelle ubiquitome kompleksitet stort mangfold i det biologiske utfallet av en bestemt UBL modifikasjon. Men mens store fremskritt i UBL biologi har blitt gjort, de presise cellulære rollene de fleste av disse ubiquitome komponenter forblir ukjent.

Bruken av korte interfering ribonukleinsyre (sirnas) har dukket opp som et kraftig verktøy i revers genetikk på grunn av muligheten for siRNAs spesifikt mot cellulære mRNA for ødeleggelse, slik at rollen til enkelte gener for å bli undersøkt i ulike biologiske sammenhenger ^tre. Hele genomet skjermer har blitt brukt til å identifisere og validere nye regulatorer av mange cellulære prosesser, og har skapt et vell av nyttige data tilgjengelig for den bredere vitenskapelige samfunnet. Men mens hele genomet skjermer har vist seg meget nyttig, er målrettet skjermer blir stadig mer populære som de er billigere, raskere, innebærer mindre data management og rapport bare på medlemmer av genomet hvor etterforskeren er mest interessert. Derfor, for å bedre forstå hvilke cellulære prosesser UBL familie komponenter er involvert i, har vi samlet en menneskelig siRNA bibliotek rettet mot alle kjente og spådd komponenter av ubiquitome. Dette inkluderer de UBLs, E1 aktive enzymer, E2 konjugeringsreakenzymer, ligaser E3, ubiquitin-bindende domene (UBD)-inneholdende proteiner og DuBS. Dette biblioteket kan brukes til skjermen mot et bredt spekter av rapportørcellelinjer av forskjellige biologiske problemer, og dermed gir objektive identifisering av nye UBL komponenter som styrer disse banene.

Følgende protokoll beskriver hvordan du utfører en streng målrettet siRNA ubiquitome skjermen for å identifisere nye regulatorer av HIF1A avhengig respons på hypoksi. Under normal oksygen spenning, er HIF1A lagt prolyl hydroksylering som får den til å bli anerkjent og målrettet for nedbrytning ved Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase kompleks ^fire. Hypoksi hemmer prolyl hydroksylering som fører til stabiliseringen av HIF1A og påfølgende binding til hypoksi responselementer (HRes) for å drive gene expression. Her beskriver vi en skjerm ved hjelp av U20S osteosarkom-celler stabilt uttrykker ildflue luciferase under kontroll av tre tandem kopier av Hypoxia Response Element (U20S-HRE celler) ^5. Denne protokollen kan tilpasses for en hvilken som helst biologisk vei hvis en robust avlesing av reporter-aktivitet kan oppnås, og kan være kombinert med passende positive og negative kontroller.

Protocol

En. Assay Development Stage

Merk: før start av siRNA-skjermen, er avgjørende for å sette ut viktige parametre for screening med reporteren cellelinje en analyse utviklingsfase. Det er viktig å investere betydelig innsats på dette stadiet da dette vil underbygge fremtidig suksess på skjermen.

1. For å karakterisere den hypoksi-responsen til U20S-HRE rapportørcellelinje vokser 2 x 75 cm ² kolber av U20S-HRE celler til 80-90% sammenløp i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% FBS.
2. Aspirer media fra en kolbe av celler, vaskes to ganger med 10 ml PBS og løsne cellene ved tilsetning av 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning og inkubere ved 37 ° C i 5 min. Resuspender celler i 8 ml DMEM 10% FBS, og pipetten opp og ned for å skape en homogen cellesuspensjon.
3. Pipetter 20 mL av suspensjonen til en celle telling kammer, i to eksemplarer, og sette inn i kammeret i en automatisert celle counter. Klikk på "Display Image" på celleteller programvare og sikre cellene er i fokus. Klikk på "Count" og noterer celletettheten. Gjenta dette for den andre duplikat og beregne gjennomsnittlig celletettheten. Fortynn cellene med DMEM 10% FBS i en konsentrasjon på 60000 celler / ml.
4. Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 100 mL (6000 celler) av de fortynnede cellene til de samme tre kolonner (f.eks A5-H5, A6-H6 og A7-H7) av fem sterile hvite vegger 96-brønners analyse plater, og overføring til en fuktet 37 ° C inkubator med 5% _CO2 over natten. Merk: disse platene vil bli brukt til å bestemme den hypoksi-avhengige luciferase-utgang for en rekke hypoksi eksponeringer: 0 time, 2 timer, 6 timer, 10 timer og 24 timer.
5. På slutten av dagen etter noter tiden og tilsett 24 timers hypoksi platen til hypoksi arbeidsstasjon satt til 1% oksygen. Den følgende morgen, beregne tiden 10 timer, 6 timer og 2 timer før den 24 timers platen skyldes fjernes frOM hypoksi arbeidsstasjon. På disse tider, legger 10 timer, 6 timer og 2 hr platene til hypoksi arbeidsstasjon.
6. Forbered 30 ml av 2x kombinert luciferase lyse / analysebuffer (50 mM Tris-fosfat pH 7,8, 16 mM MgCl _2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, 30% glycerol, 1 mM ATP, 1% BSA, 0,25 mM luciferin og 8 mM Na ₄ P ₂ O _7). Merk: Tilsett komponenter i den angitte rekkefølgen og lar BSA i minst 30 min for å oppløse før tilsetning av luciferin og Na _4. P ₂ O _7.
7. Fjern alle platene fra hypoksi arbeidsstasjon på riktig tidspunkt. Tilsett 100 ul av 2x luciferase lyse / forsøksbuffer til de passende brønnene i analyseplaten og dekk med klar film. Rist platene på en platerister i 10 minutter ved 500 rpm for å grundig lysere cellene.
8. Overfør platestabelen til en automatisert plate med 96 brønner luminometer rack. Under "protokoller"-menyen, velg "abs 595" og markere alt wells skal leses i platen kartet på skjermen under "godt valg"-menyen. Klikk "Kjør" for å måle luminescens av hver brønn deretter beregne gjennomsnittlig lesning av hver plate. Beregn hypoksi-avhengig fold-økning av rapportøraktivitet, ved å dividere den gjennomsnittlige lesning av hver hypoksi plate av den gjennomsnittlige avlesningen av normoksiske (0 hr hypoksi) styreplaten. Merk: Det er viktig å observere en robust hypoksi avhengig luciferase respons å være egnet for screening. En 5-10 ganger økning i reporter aktivitet anses utmerket.
9. Lag en master kontroll plate som inneholder fire høy kontroll (HIF1A siRNA) gjentak (brønner A1-D1), fire lav kontroll (FIH1 siRNA) gjentak (brønner A12-D12), fire buffer bare kontrollere gjentak (brønner E1-H1) og fire non-target siRNA kontroll gjentak (E12-H12), der alle siRNA bassenger er i en konsentrasjon på 200 Nm. Merk: Høye og lave kontroller er etablert på grunnlag av kjent sti regulatorer som øker og Decrlette hypoksi respons hhv. Alternativt kan assay utvikling ved hjelp av en undergruppe av biblioteket benyttes for å identifisere egnede kontroller.
10. Ved hjelp av en flerkanals pipette, overføre 10 mL av hver kontroll siRNA til et sterilt hvite vegger analysen plate. Forbered transfeksjon blanding av 0,1 mL transfeksjon reagens i 10 pl redusert serummedium (1:100) per brønn, og overføring av 10 ul transfeksjon blanding til hver kontrollbrønn. Pipetter opp og ned en kort stund for å blande, og la platen hvile i 20-60 minutter for å tillate transfeksjon kompleksdannelse.
11. Forbered en celle suspensjon av 75 000 celler / ml med andre kolbe U20S-HRE celler. Ved hjelp av en multikanal pipette, tilsett 80 pl (6000 celler) av cellesuspensjonen til hver transfeksjon blanding. Overfør platen til en fuktet 37 ° C inkubator med 5% _CO2 i 24 timer, og deretter overføre til en hypoksi-arbeidsstasjon for en ytterligere 24 timer og luciferase utføre assays som beskrevet i trinn 1.6-1.8.
12. Beregn Z-faktor for de høye og lave kontroller ved hjelp av formelen Z = 1 - [3 x (standardavvik av høy kontroll + standardavvik for lav kontroll) / (gjennomsnittlig høy kontroll - gjennomsnittet av lav kontroll)]. Merk: en verdi på mellom 0,5-1 indikerer en utmerket assay og bør tilstrebes.

2. Primær skjerm

Merk: Når disse grunnleggende forhold fra analysen utviklingstrinn er på plass, kan den primære skjermen utføres i triplikat i 96-brønners plateformat ved hjelp av følgende protokoll.

1. Dyrk 7 x 75 cm ² kolber av U20S-HRE celler til 80-90% sammenløp i DMEM supplert med 10% v / v kalvefosterserum (FCS).
   Merk: Følgende trinn 02.02 til 02.13 skal utføres på Dag 1.
2. Initiere replikere 1 ved fremstilling av en master-plate inneholdende 200 ul av hver kontroll som beskrevet i trinn 1.9 og tining av en fortynning serie av siRNA ubiquitome library i minst 30 min. Merk: hver brønn inneholder en pool av fire siRNAs samlet i 17 x 96-brønners plater med kolonne 1 og 12 stående tomme for kontroller.
3. I en laminær hette, etikett (eller bar-code) 17 sterile hvite vegger analyse plater med lokk fra tallene 1-17, som tilsvarer hver plate av siRNA bibliotek serien.
4. Sentrifuger på hovedkontrollplaten og siRNA ubiquitome biblioteket kort (1 min ved 2000 x g) for å sikre at alle siRNAs akkumuleres på bunnen av brønnen.
5. Bruk en automatisert flytende dispenser til robot "stempel" 10 mL av hver kontroll fra master kontroll platen på de 17 analyse plater, bruker den samme 96-godt tips stabelen for hver plate.
6. Ved hjelp av en frisk 96-brønns tip stabel for hver av de 17 bibliotek plater, overføre 10 ul av hver ubiquitome siRNA til dens tilsvarende assay-plate ved hjelp av en automatisert væskedispenser.
7. Forbered 40 ml transfeksjon reagens for de 17 analyse plater ved hjelp av ratio esikke etablert i 1.10. Merk: Dette inkluderer ytterligere 20 ml å redegjøre for «død volum" i cellen dispenser. Den "dødvolum" refererer til det væskevolum stadig til stede inne i røret nettverket i cellebeholderen.
8. Bruk av en automatisert celle dispenser for å overføre 10 ul av transfeksjon reagens til hver brønn i 17 analyseplater. Kort rist analyseplater på en riste (1 minutt ved 500 rpm) for å tillate grundig blanding av siRNA og transfeksjon reagens, og deretter la fortsatt ved romtemperatur i 20 til 60 min for å tillate siRNA: transfeksjon reagens kompleksdannelse.
9. Vask to 75 cm ² kolber av U20S-HRE cellene to ganger med 10 ml PBS og løsner med 2 ml trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 min. Tilsett 8 ml DMEM 10% FBS til hver kolbe og pipette opp og ned flere ganger for å lage en homogen cellesuspensjon. Kombiner celler fra både kolber og overføre til en steril 50 ml plastrør.
10. Beregn cellekonsentrasjonen ved pipettering20 ul celler i to eksemplarer i et celletellekammer og beregne den gjennomsnittlige celle-konsentrasjon mellom to målinger av et automatisk celleteller som beskrevet i trinn 1.3.
11. Forbered 155 ml av cellesuspensjon ved å fortynne med DMEM 10% FBS i en konsentrasjon på 75.000 celler per ml i sterile plastbeholder. Merk: Dette volum er tilstrekkelig for 17 platene, og inkluderer ytterligere 25 ml for tomrom i cellebeholderen.
12. Legg et sterilt magnetrører til cellen suspensjon og legg på en røre satt opp inne i laminær hette å begrense celle klumper. Stabilisere den automatiserte celle dispenser med cellesuspensjonen og sette den til å dispensere 80 mL av celler per brønn (6000 celler).
13. Plasser hver av de 17 plater, i sin tur, på automatisert cellebeholderen og dispensere celler. Noter tid og stable platene i grupper på fem og deretter plassere stabler i en fuktig 37 ° C inkubator ved 5% CO ₂ for 24 hr. Merk: sluttkonsentrasjonen avsiRNA bassenget vil være 20 nM i 100 pl totalt volum.
    Merk: Følgende trinn 02.14 til 02.15 skal utføres på dag to.
14. Initiere andre replikere på dag to, etter fremgangsmåten i dag en for replikere en (02.02-02.13).
15. Etter 24 timer av transfeksjon, overføringsplater fra replikere en i et sterilt miljø til en hypoksi arbeidsstasjon satt til 1% oksygen og la stå i 24 timer for å indusere HRE reporter.
    Merk: Følgende trinn 02.16 til 02.20 skal utføres på Dag 3.
16. Initiere tredje replikere ved å følge prosedyren beskrevet i dag en for replikere en (02.02-02.13).
17. Etter 24 timer av transfeksjon, overføringsplater fra replikere to i et sterilt miljø til en hypoksi arbeidsstasjon satt til 1% oksygen og la stå i 24 timer for å indusere HRE reporter.
18. To timer før replikere 1 plater som skal fjernes fra arbeidsstasjonen hypoksi, forberede 200 ml 2x luciferase lyse / analysebuffer som beskrevet i 1.6. Merk: dette volumet iinkluder ytterligere 20 ml for å sikre at bufferreservoaret forblir godt dekket.
19. Fjern gjenskape en analyseplater fra hypoksi arbeidsstasjonen etter 24 timer hypoksi eksponering og ved hjelp av en automatisert væskedispenser, tilsett 100 ul av 2x luciferase lyse / forsøksbuffer til hver analyseplate og dekke med klar film.
20. Rist platene i en celle rister i 10 minutter ved 500 rpm for å grundig lysere cellene. Overfør hver plate i sin tur til et luminometer plateavleseren og plate luminescens som beskrevet i trinn 1.8.
    Merk: Følgende trinn 02.21 til 02.22 skal utføres på Dag 4.
21. Etter 24 timer av transfeksjon, overføringsplater fra replikere tre i et sterilt miljø til en hypoksi arbeidsstasjon satt til 1% oksygen og la stå i 24 timer for å indusere HRE reporter.
22. Les den replikere to plater ved å følge trinn 02.18 til 02.20 brukes for replikere en.
    MERK: Følgende trinn 2.23 bør utføres på dag fem.
23. Les replikere tre plater ved å følgetrinn 02.18 til 02.20 brukes for replikere en.
24. Kompilere alle tre replikater av den primære skjermen, og beregne Z faktor for hver plate ved hjelp av formelen gitt i 1.12. Merk: hvis en plate har et Z-faktor på mindre enn 0,5, anser å gjenta denne plate for å forbedre datakvaliteten.
25. Beregn koeffisienten av varians (CV) for de høye og de lave kontroller ved hjelp av følgende formel: 100 x standard avvik av kontroll / gjennomsnitt av kontroll. Merk: CV bør være så lav som mulig, er det rimelig å forvente 10-15% variasjon. Dersom varianten er betydelig høyere, bør gjentas plate.
26. Beregn prosent aktivering av hver siRNA per plate ved hjelp av følgende formel: [(middel av høy kontroll - siRNA score) / (middel av høy kontroll - middel av lav kontroll)] x 100 I tillegg beregne den ikke-target (NT. ) ganger på hver siRNA ved hjelp av formelen [Prøve data / gjennomsnitt av NT]. For begge prosent aktivisering og NT-fold, beregne gjennomsnittet av de tre replicates og kompilere verdiene.
27. Ved hjelp av rådata, beregne Spearmans Rank Correlation Coefficient (SRCC) for å finne ut hvor nært de tre replikat plater korrelerer med formelen:
    
    hvor r = SRCC; d = forskjellen mellom de to tall i hvert par av rekker og n = antallet av par med data. Merk: en god korrelasjon mellom plate gjentak vil gi verdier nær 1 Hvis man replikere viser lav SRCC mot de andre to plater, undersøke nærmere og vurdere å gjenta at plate..
28. Bestem hvilke sirnas er av tilstrekkelig interesse for sekundærscreening (opp til 80). Ansett brukerdefinerte cut offs (f.eks velge alle sirnas viser mindre enn 5% eller over 95% prosent aktivering, eller mindre enn 0,5 NT-fold eller over 1,5 NT-fold) eller bruke bioinformatikk eller kunnskapsbasert argumentasjon for å søke etter klynger av treffer faller innenfor samme UBL veien. Merk:på vanlig måte, en kombinasjon av disse metodene bestemmer hvilke siRNA tas i sekundær screening.

Tre. Sekundær skjerm

Merk: en bekreftende sekundære skjermen er utført basert på maksimalt 80 siRNAs av interesse fra den primære skjermen. Dette antallet kan beleilig utføres med hver replikat belagt på en enkelt plate med 96 brønner med full kontroll i henhold primærskjerm (se 2.2). Det er meget nyttig for å bekrefte at de regulatorer som er identifisert i den primære skjermen reproduserbart fremkalle den samme fenotype, og dette vil hjelpe til raffinering triage avgjørelser om hvilke treff skal kunne gjennomføres til den endelige tertiære / deconvolution skjerm.

1. Grow 1 x 75 cm ² kolbe U20S-HRE celler til 80-90% samløpet i DMEM med 10% FBS.
2. Legg merke til plate nummer og plassering av de primære skjermen treff, og planlegger den nye plasseringen på den sekundære skjermen kirsebær plukket master plate, forlater kolonner en end 12 gratis for kontroller. Klargjør styre master plate som i 1.9, men med et totalvolum på hver kontroll av 50 pl.
3. Tine en andre fortynning serie av ubiquitome bibliotek (avsatt til cherry-picking individuelle siRNA bassenger) i minst 30 min. Sentrifuger platene kort (1 min ved 2000 xg) deretter legge 50 mL av de sekundære skjermen siRNAs til deres nye plate steder på kirsebær plukket master plate.
4. Utfør den sekundære skjermen ved hjelp av den samme grunnleggende protokollen beskrevet for den primære skjerm med følgende modifikasjoner: (a) kjøre alle tre replikater på samme dag i en analyseplate per replikere og (b) justere mengder av reagenser tilsvarende.

4. Tertiær / Deconvolution Screen

Merk: tertiær eller deconvolution screening utføres på maksimalt 20 siRNAs fra den sekundære skjermen. Dette trinnet er å undersøke effekten av å bruke knockdown enkelte siRNA fra den opprinnelige pool på fire. Normalt skal minst to individuelle siRNA tomannsboliger fra hver bassenget illegale samme fenotype å ha en rimelig grad av tillit til at den observerte fenotype er ikke på grunn av siRNA off-target effekter. For ytterligere å øke tilliten på dette stadiet, kan flere individuelle siRNA tomannsboliger rettet genet i spørsmålet være konstruert og testet for sin evne til å lokke fram den gitte fenotype. Resultatene fra disse forsøkene kan deretter brukes til å beregne H poengsum, der H = 0,6 eller over (dvs. der minst tre av fem individuelle siRNAs framprovosere fenotype) anses som akseptabel ^seks.

1. Grow en 75 cm ² kolbe U20S-HRE celler til 80-90% samløpet i DMEM med 10% FBS.
2. Lag en plate kartet for tertiær skjermen ved å planlegge plasseringen av de fire individuelle siRNA tomannsboliger av hvert treff på universitets-/høyskolenivå skjermen master plate, forlater kolonne 1 og 12 fri for kontroller. Klargjør styre master plate som i 1.9, men med en totalVolumet av hver kontroll av 50 pl.
3. Tin dekonvolusjon / individuell siRNA plater og tilsett 50 pl av de enkelte siRNAs (200 nM) i hver brønn av den tertiære skjermen master plate ifølge kartet platen (4.2) for å tillate tre x 10 mL replikater og en komfortabel 20 pl overskytende .
4. Utfør den tertiære skjermen ved hjelp av den samme grunnleggende protokollen beskrevet for den primære skjermen med de følgende modifikasjoner: (a) kjøre alle tre replikater på samme dag i en analyseplate per replikere og (b) justere mengder av reagenser tilsvar

Merk: Ideelt terskelen for enkelte siRNA tomannsboliger bør settes på samme stringens cut-off som for bassenget. Imidlertid kan det være akseptabelt å slappe av terskelen med 10-20% for de enkelte siRNAs, særlig hvor i det minste en annen duplex faller innenfor den innstilte terskelen. Det er verdt å huske på at den enkelte effekten av sirnas kan være mindre enn forbassenget, og omvendt, i noen tilfeller individuelle siRNAs kan vise en sterkere effekt på cellulær fenotype isolert enn når den finnes i bassenget (selv når konsentrasjonen er rede for).

Representative Results

Før screening, er hypoksi-respons fra U20S-HRE celler etablert. U20S-HRE celler uttrykker en reporter konstruksjon bestående av ildflue luciferase sammensmeltet nedstrøms fra tre tandem kopier av den hypoksi-responselement, som er bundet av den HIF1A/HIF1B heterodimer ved eksponering overfor hypoksi (figur 1A). Cellene er plassert i en hypoksi-arbeidsstasjon for en rekke ganger for å etablere som hypoksi eksponering gir den mest effektive respons for screening. U20S celler uttrykker lave nivåer av HIF2A, derfor luciferase målinger er i stor grad avhengig av hypoksi-mediert HIF1A stabilisering ^7. Eksponering av U20S-HRE celler til hypoksi for 0 hr, 2 t, 4 t, 6 timer og 24 timers resultater i en hypoksi-avhengig induksjon av luciferase aktivitet (Figur 1B). Eksponering av U20S-HRE celler til hypoksi i 24 timer resulterer i en ~ 10 ganger induksjon av aktivitet (figur 1B), og derfor representerer dette enn utmerket respons for siRNA screening.

Å etablere egnede høye og lave kontroller, er sirnas til HIF1A og FIH1 brukes til å reversere transfektere U20S-HRE celler. Celler ble transfektert med kontrollene i 24 timer og utsatt for hypoksi i ytterligere 24 timer før luciferase assay blir utført. HIF1A siRNA minsker hypoksi signal til rundt 10%, mens den FIH1 siRNA forbedrer hypoksi-signalet til omkring 170% i forhold til ikke-target siRNA (figur 2). Disse kontrollene resultere i en gjennomsnittlig Z-faktor på 0,8, noe som er et utmerket score for screening. De rastreringsparametre har nå blitt etablert for en robust skjerm.

Den primære skjermen er utført i 96-brønn plate-format ved hjelp av arbeidsflyten vist i figur 3.. Control and bibliotek sirnas er stemplet på analyseplater (figur 3A), og U20S-HRE celler blir transfektert deretter i omvendtinkubert ved 37 ° C i 24 timer. Analyseplatene deretter eksponert for hypoksi i 24 timer (fig. 3B) før luciferase assay blir utført, og dataene analyseres (figur 3C). Kvalitetskontroll-analyse av skjermen omfatter å bestemme Z-faktor for hver plate, hvor en Z-faktor over 0,5 er ønskelig ^{8, 9.} Z faktoren beregnes for hver plate i triplikat primære skjermen ved hjelp av formelen i figur 4A. Z-faktorene for hver plate er visualisert ved hjelp av en spredningsdiagram, hvor den kan bli sett hver plate har et Z-faktor større enn 0,5 (figur 4B). Beregning av Z faktor er viktig fordi det rapporter om hvor god en separasjon vindu eksisterer mellom kontroller og kan markere potensielle problemer med individuell skjerm analyse plater. CV av de høye og lave kontroller er også beregnet, og gjennomsnittene er 5,95% + / - 0,4 og 8,04% + / - på henholdsvis 1.2. Den primære skjermenresulterer i en fordeling av siRNA duplekser som danner en sammenheng mellom de lave og høye kontroller. Vanligvis vil det være omtrent like mange positive og negative regulatorer, med de fleste av siRNAs å ha noen effekt på reporter (figur 5). Regulatorer av interesse er tatt gjennom til andre så tertiær screening for å etablere en liste over høy tillit regulatorer for oppfølging analyse og validering.

Figur 1. Hypoksi eksponering induserer U20S-HRE luciferase reporter. (A) Skjematisk representerer hypoksi reporter konstruere i U20S-HRE celler brukes for siRNA screening. Tre tandem kopier av hypoksi responselement (HRE) er bundet av HIF1A/HIF1B heterodimer å drive eXpression av ildflueluciferase. (B) å øke eksponeringen av U20S-HRE celler til 2 timer, 6 timer, 10 timer og 24 timer for å hypoksi ende økende mengder av reporter luciferase-aktivitet. 24 hr hypoksi resultater eksponering i ~ 10 ganger økning i luciferase aktivitet sammenlignet med 0 hr kontroll (normoksiske). Scale barer representerer standardfeilen for gjennomsnittet.

U20S-HRE celler Figur 2. Etablering høye og lave siRNA kontroller for screening. Omvendt transfektert med siRNA til HIF1A (lav kontroll) og FIH1 (høy kontroll) redusere og øke responsen på 24 timers hypoksi eksponering henholdsvis. Disse kontrollene gir en Z-faktor på 0,8, som er ansett som et utmerket score for screening. Effekten av ikke-target (NT) siRNA er vist forsammenligning. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.

Figur 3. Arbeidsflyt Screening for å identifisere regulatorer av HIF1A hypoksi respons. (A) Arrangement av 96 brønners plater for siRNA screening. Kontroll sirnas er stemplet på utsiden kolonner som er oppgitt, og den ubiquitome siRNA biblioteket er stemplet på innvendige søyler, fordelt over 17 plater. U20S-HRE celler er omvendt-transfektert og inkuberes ved normoksiske for 24 hr. (B) Stabler av analyseplatene blir overført i et sterilt miljø til en hypoksi-arbeidsstasjon satt til 1% oksygen i 24 timer. (C) Plater blir fjernet fra hypoksi arbeidsstasjon og luciferase aktivitetsanalyse blir utført på alle analyseplater. Luminescence ertatt opp på et luminometer og dataanalyse utføres for å etablere rapportøraktivitet av celler transfektert med hvert bibliotek siRNA.

Kvalitetskontrollen Figur 4. Blir utført ved å beregne Z faktor på hver plate. (A) Z-faktor for hver plate er beregnet ved hjelp av formelen gitt, hvor s representerer standardavviket, m representerer middelverdien, s. den positive kontroll og n den negative kontrollen. (B) Scatter plott som viser den beregnede Z faktor på hver plate fra de tre gjentak av ubiquitome skjermen. En cut-off på 0,5 er anvendt, og i dette tilfellet vil alle platene viser en Z-faktor> 0,5, og derfor passerer kvalitetskontroll.

Figur 5. Figur som viser fordelingen av den siRNA-biblioteket. Graf som viser frekvens på siRNAs fra triplikat ubiquitome siRNA skjerm som resulterer i den tilsvarende prosent aktivering. Lave og høye kontroller er satt til 0% og 100% henholdsvis. Den siRNA-biblioteket blir jevnt fordelt mellom de høye og lave styre, hvorved størstedelen av siRNAs har ingen effekt på den cellulære fenotype. En liten andel av sirnas er observert å øke og redusere responsen, og derfor representerer de potensielle nye regulatorer av veien.

Discussion

Bruken av genom-wide siRNA skjermer i pattedyrceller har vist seg å være svært verdifull i å identifisere nye regulatorer av forskjellige biologiske mekanismer. Her har vi beskrevet bruken av en målrettet ubiquitome siRNA skjermen for å identifisere regulatorer av HIF1A-mediert cellulær respons til hypoksi. Målrettede skjermer blir stadig mer attraktive som de er generelt billigere, raskere, enklere å administrere og rapportere bare på komponentene løp hvor etterforskerne er interessert ^{7, 10, 11.}

Det er viktig å sette en stor innsats i analysen utviklingstrinn for å sikre at den grunnleggende celle reporter er egnet for screening, og at reproduserbarheten og lav variabilitet kan oppnås. Det er også viktig å velge robuste positive og negative kontroller for å skape et vindu av separasjon innen hvilke bibliotek regulatorer vil falle. I tillegg er disse fungere som en intern kontroll i hver analyse tallerkenskjermen, slik at for rask identifisering av eventuelle problemer med individuelle plater.

Et vanlig problem i high throughput screening er forekomsten av platekanteffekter, noe som kan være forårsaket av en lokal forskjell i fuktighet ved de ytre brønnene i platen i forhold til de indre brønner. Etter å ha de passende kontrollene på plass og å skape en varme-kart av platen utgang kan bidra til å identifisere dette problemet. Vi har funnet at kanteffekter kan overvinnes ved hjelp av fuktig silkepapir ved foten av platene, og å plassere et stivt, gjennomsiktig plastpose over platestabelen for å gjøre mikromiljøet av hver plate inne i inkubatoren jevnere.

En begrensning av siRNA screening er tilstedeværelsen av falske positive og falske negative. Falske negativer kan oppstå på grunn av en rekke faktorer, inkludert utilstrekkelig knockdown av det tilsvarende mRNA, eller muligheten av gjenværende mRNA for å produsere nok active protein til effektivt å utføre sin funksjon. Falske positiver er mer problematisk, da de kan føre til en etterforsker til å investere betydelig tid å følge opp en hit som ikke kan faktisk styre veien i spørsmålet. Falske positiver kan genereres gjennom en rekke mekanismer, inkludert via siRNA off-target effekter. Det er der den siRNA slår ned ikke bare mRNA i spørsmålet, men også andre, uidentifiserte mål som er den sanne sti regulatorer ^{12, 13.} En rekke tilnærminger blir ofte brukt og akseptert som en bekreftelse på at den observerte fenotype er et sant resultat av knocking ned målgenet aktuelle ^14.. For eksempel kan problemet med off-target virkninger kan overvinnes delvis ved tertiær screening, hvorved sannsynligheten for mer enn ett individ siRNA fra utgangs-pool av fire med samme ut-target-effekten blir redusert. I tillegg klarer å utføre redningsforsøk med siRNA-resistentecDNA som tilsvarer treff vil også utelukke off-target-effekter. Det skal bemerkes at denne fremgangsmåten er i seg selv ikke uten begrensninger, f.eks eksogent overexpressed proteiner vil ikke nødvendigvis fungere identisk til den endogene motstykke på grunn av endret støkiometri av de relevante komplekser eller opprørt posttranslasjonelle modifikasjoner etc. En alternativ tilnærming for å treffe validering derfor er å generere eller erverve knockout eller banke-i cellelinjer som tilsvarer treff, og avgjøre om disse cellelinjene viser samme fenotype som siRNA knockdown. Dermed kan begrensninger av siRNA screening overvinnes med forsiktig eksperimentell oppfølging. Videre objektiv identifisering av ekte modifikatorer av stiene var under granskning langt oppveier problemene forbundet med potensielt identifisere falske positiver.

I sammendraget, siRNA screening med en målrettet "ubiquitome" siRNA bibliotek er en powerful metode for å identifisere nye medlemmer av ubiquitin og ubiquitin-lignende modifikatorer som regulerer forskjellige biologiske mekanismer. Den protokoll som er beskrevet her kan brukes på en hvilken som helst biologisk problem hvis det er en robust avlesing av rapportøraktivitet. Den endelige listen med høy grad av sikkerhet treffer fra skjermen representerer utgangspunktet hvor for å etablere det mekanistiske grunnlag av hvor hvert treff styrer pathway det gjelder. Til syvende og sist, vil dette legge til den økende kunnskap om hvordan ubiquitin og ubiquitin-lignende modifikatorer regulere forskjellige biologiske mekanismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Liquid Dispenser	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
White Walled Assay Plate	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Clear Plate Film	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA library	Thermo Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Transfection reagent	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Reduced Serum Medium	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#