جمع واستخراج الحمض النووي من اللعاب لتسلسل الجيل القادم
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
الحصول على الحمض النووي عالية الجودة للدراسات الجينية البشرية أمر أساسي في عملية اكتشاف الجين المرض. الدم، على الرغم تتطلب إجراء الغازية وكونها أكثر تكلفة من جمع اللعاب أيضا، ويحظي لإنشاء خطوط الخلايا خلد كمصدر لانهائي من الحمض النووي، أو iPSCs للدراسات وظيفية، وأحيانا يستخدم الحمض النووي في الدم عند خطوط الخلايا غير متوفرة. ومع ذلك، يتطلب الحصول على الدم فصاد المدربين والدم لديه نصف عمر أقصر من اللعاب 1. DNA من اللعاب هو أقل كلفة وأكثر سهولة الحصول عليها، لأنها يمكن جمعها وإرسالها عبر البريد دون الحاجة إلى فصاد، وبالتالي زيادة برك الموضوع المحتملة إلى ما وراء منطقة مستجمعات المياه من المستشفيات والمختبرات 2. يمكن تحسين التحاق دراسة عندما يكون الخيار من المواضيع إعطاء عينة من اللعاب بدلا من الدم 3، 4. المخاوف بشأن كمية ونوعية الحمض النووي من اللعاب قد تقتصر على نطاق واسع لناه على الرغم من العديد من الدراسات الدراسات الحديثة تظهر مدى ملاءمة اللعاب كله، بمتوسط قدره 4.3 × 10 5 خلية في الملليمتر الواحد، لاختبار الحمض النووي على مدى القديمة مسحات الشدق الأساليب التي لم تحصل على كميات كبيرة من اللعاب 2، 3، 4، 5، 6. في حين أن الأدب متواضع موجود تبين مدى ملاءمة DNA اللعاب كله مستمد للتطبيقات بما في ذلك أساليب التنميط الجيني القائم على ميكروأري 8، 9، 10، وقد درست توجد دراسات الجيل القادم التسلسل (خ ع). كان الهدف لتحسين هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي اللعاب كله لتحقيق أقصى قدر من كمية ونوعية لتطبيقات علم الوراثة بطريقة فعالة من حيث التكلفة التي يتم تنفيذها بسهولة في المختبرات المشتركة مع الكواشف والمواد الاستهلاكية.
استخراج الحمض النووي من اللعاب يتطلب العديد من الإجراءات: 1) جمع وتخزين، 2) تحلل الخلايا، 3) العلاج ريبونوكلياز، 4) البروتين هطول، 5) هطول الأمطار الإيثانول، 6) الإماهة الحمض النووي. الحل DNA لتحقيق الاستقرار العازلة، وصفت2 سابقا، وظائف كاف دون تغيير. ولم تبذل أية محاولة لتحسين العلاج ريبونوكلياز وDNA الخطوات الإماهة. لكل خطوة المتبقية، وقد تم تحديد العديد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على الإنتاجية. تم التلاعب بها كل متغير على حدة وتقييم التحسن في المحصول وجودة إحصائيا. للمتغيرات التي عرضت لتحسين العائد و / أو نوعية الحمض النووي، وأدرجت القيم المثلى في البروتوكول النهائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء الحالي هو الأمثل DNA بروتوكول الاستخراج التي قد تحسن بشكل كبير العائد من الحمض النووي الوزن الجزيئي عالية مقارنة بالطرق القياسية، دون المساومة على جودة DNA. كانت الخطوة الحاسمة مع أكبر تأثير على العائد على معظم خطوة 5.2، والذي يتضمن خطوة الطرد المركزي أطول أثناء…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Riferimenti
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
