DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
İnsan genetik çalışmalar için yüksek kalitede DNA temininde hastalık geni bulma işlemi esastır. Kan, tükürük toplama daha pahalı olması da invaziv işlemler gerektiren ve rağmen, fonksiyonel çalışmalar için sonsuz bir DNA kaynağı veya iPSCs olarak ölümsüzleşti hücre hatları oluşturmak için tercih edilir ve hücre hatları mevcut olmadığında bazen kan DNA kullanılır. Bununla birlikte, kan elde eğitimli bir flebotomist gerektirir ve kan tükürük 1 daha kısa bir yarı-ömrü vardır. O toplanan ve böylece iyi hastane ve laboratuvarlardan 2 su toplama alanı dışında potansiyel denek havuzu artan flebotomist için gerek kalmadan posta yoluyla gönderilen olabilir beri tükürük DNA elde etmek daha az pahalı ve daha kolaydır. Konular yerine kan 3, 4 bir tükürük örneği vererek seçeneği varken Çalışması okullaşma gelişmiş olabilir. Miktar ve tükürük DNA kalitesi ile ilgili endişeler bizi yaygın sınırlı olabilirtükürük 2, 3, 4, 5 önemli miktarda elde etmedi eski yanak bezlerden yöntemleri üzerinde DNA testi için mililitre başına 4.3 x 10 5 hücre ortalama ile, bütün tükürük uygunluğunu gösteren çok sayıda çalışma son çalışmalarda rağmen e, 6. mütevazı bir edebiyat microarray tabanlı yöntemler 8, dahil genotiplendirme uygulamalar için bütün tükürük edilen DNA uygunluğunu gösteren var iken 9, 10, herhangi bir çalışma inceleyen gelecek nesil dizileme (NGS). Bütün bu tükürük DNA ekstraksiyon protokolü optimize etmek için hedefe kolaylıkla ortak reaktifler ve sarf malzemeleri ile laboratuarlarda uygulanan maliyet etkin bir şekilde genetik uygulamalar için miktar ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak oldu.
Tükürük DNA ekstraksiyon çeşitli prosedürler gerektirir: 1) toplama ve depolama, 2) hücre parçalama, 3) RNaz tedavisi, 4) protein çökelmesi, 5) etanol yağış, 6) DNA rehidrasyon. Tarif edilen DNA sabitleştirme Tampon çözelti,Daha önce 2, yeterince değişiklik olmadan fonksiyonları. RNaz tedavi ve DNA rehidrasyon adımları optimize için hiçbir girişimde bulunuldu. Kalan her adım için, verimi etkileyebilecek çeşitli değişkenler tespit edilmiştir. Her bir değişken ayrı ayrı manipüle edilmiş ve verim ve kalitesinde iyileşme istatistiksel olarak değerlendirildi. Veriminin ve / veya DNA kalitesini geliştirdiği gösterildi değişkenler için, en uygun değerleri final protokolüne dahil edilmiştir.
Bu prosedür, büyük ölçüde DNA, kaliteden ödün vermeden, standart yöntemlere göre daha yüksek molekül ağırlıklı DNA verimini geliştirilmiş bir optimize edilmiş DNA ekstraksiyon protokolüdür. Verim çoğunda büyük etkisi ile kritik adım, yaygın olarak 11 dağıtılan değildi biri hariç, burada gözden yayınlanmış herhangi bir protokol daha etanol yağış sırasında uzun bir santrifüj aşamasını kapsamaktadır adım 5.2 oldu. Bu daha santrifüj ile bağlantılı DNA kalitesinde…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
Proteinase K | Sigma | P6556 |
Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
Isopropanol | Fisher | A416-4 |
Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
NaCl | Fisher | AC194090010 |
Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
Equipment | ||
Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |