איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם 3, 4. חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 5 תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק 2, 3, 4, 5, 6. בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray 8, 9, רצף 10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים.
מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר 2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Riferimenti
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
