Indsamling og brydning af spyt DNA til Next Generation Sequencing

Summary

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Abstract

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

Introduction

Opnåelse af DNA høj kvalitet til humane genetiske undersøgelser er afgørende i sygdomsgen opdagelse proces. Blod, men kræver en invasiv procedure, og er dyrere end spyt indsamling, foretrækkes til at skabe immortaliserede cellelinier som en uendelig kilde af DNA, eller iPSCs til funktionelle undersøgelser og undertiden blod DNA anvendes når cellelinjer er ikke tilgængelige. Men at få en blodprøve forudsætter en veluddannet bioanalytikeren og blod har en kortere halveringstid end spyt ^1. DNA fra spyt er billigere og lettere at opnå, da det kan opsamles og sendes via e-mail uden behov for en bioanalytikeren og derved øge potentielle underlagt puljer langt ud over det opland af hospitaler og laboratorier ^2. Undersøgelse indskrivning kan forbedres når motiverne har mulighed for at give en spyt prøve i stedet for blod ^{3, 4.} Bekymringer om mængden og kvaliteten af DNA fra spyt kan have begrænset sin udbredte ose trods talrige undersøgelser nylige undersøgelser, der viser egnethed hele spyt, med et gennemsnit på 4,3 x 10 ⁵ celler per milliliter, for DNA-test i løbet af de ældre buccale svaberprøver metoder, der ikke opnåede betydelige mængder af spyt ^{2, 3, 4, 5, 6.} Selv en beskeden litteratur eksisterer viser egnetheden af hele spyt afledt DNA til genotypebestemmelse applikationer, herunder microarray-baserede metoder ^{8, 9, 10,} har ingen undersøgelser undersøgt næste generation sekventering (NGS). Målet for at optimere hele denne spyt DNA-ekstraktion protokol var at maksimere kvantitet og kvalitet for genetik applikationer på en omkostningseffektiv måde, der er let gennemføres i laboratorier med fælles reagenser og hjælpematerialer.

DNA-ekstraktion fra spyt kræver flere procedurer: 1) indsamling og opbevaring, 2) cellelyse, 3) RNase behandling, 4) proteinudfældning, 5) ethanolfældning 6) DNA rehydrering. DNA stabilisering Bufferopløsning beskrevettidligere ^2, fungerer tilstrækkeligt uden ændringer. Ingen forsøg på at optimere RNase behandling og DNA rehydrering trin blev foretaget. For hver af de resterende trin blev flere variabler, der kan påvirke udbyttet identificeret. Hver variabel blev manipuleret individuelt og forbedring af udbytte og kvalitet blev vurderet statistisk. For variabler, der blev vist at forbedre udbyttet og / eller DNA-kvalitet, blev de optimale værdier inkluderet i den endelige protokol.

Protocol

BEMÆRK: Før levere spytprøver alle fag gav informeret samtykke i overensstemmelse med de retningslinjer for behandling af humane fag på Nationwide Børnehospital. 1. Spyt Indsamling og opbevaring Forud for spyt samling, at emnet mund er fri for fødevarer eller andre fremmede stoffer ved at have emnet skylle munden med vand og undgå at spise eller drikke i 30 minutter før opsamling af prøven. Åbn et 15 ml centrifugeglas med 2,5 ml af DNA stabilisering buffer 2 og sørg for…

Representative Results

For at bestemme optimale parametre til DNA-ekstraktion af en række parrede DNA ekstraktioner blev udført. En enkelt spytprøve blev delt, og hver portion med en af ​​to mulige værdier for en given variabel. Mindst otte gentagelser af hver parret test blev udført (fx blev en enkelt spytprøve alikvoter at teste ekstraktion både med og uden indledende 50 ° C inkubation). Optimering var baseret på fire standard målinger: total DNA udbytte, den 260/280 værdi, 260/230 værdi, og visuel inspektion af ele…

Discussion

Den foreliggende fremgangsmåde er et optimeret DNA-ekstraktion protokol, der har betydeligt forbedret udbytte af DNA med høj molekylvægt i forhold til standard metoder, uden at kompromittere DNA-kvalitet. Det kritiske trin med den største effekt på udbyttet mest var trin 5.2, som indeholder en længere skridt centrifugering under ethanoludfældning end nogen publicerede protokol revideret her, medmindre der blev ikke udbredt ^11. Ingen ændringer i DNA-kvalitet, der er forbundet med dette længere centrif…

Materials

15ml Centrifuge Tubes	Fisher	12-565-268
Cell Lysis Solution	Qiagen	158908
Proteinase K	Sigma	P6556
Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
Glycogen	EZ-BioResearch	S1003
70% Ethanol	Fisher	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA(0.5M) Solution	Fisher	03-500-506
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher	BP166-100
Equipment
Name of Equipment	Distributor	Catalog#
Analog Vortex Mixer	Fisher	02-215-365
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 000.010