DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Erzielen hoher Qualität für die menschliche DNA genetische Studien ist wichtig, in der Krankheit Gen Entdeckungsprozess. Blut, obwohl erfordern ein invasives Verfahren und auch teurer als Speichelsammlung wird zum Erzeugen immortalisierter Zelllinien als eine unendliche Quelle von DNA oder iPSCs für funktionelle Studien bevorzugt, und manchmal Blut-DNA wird verwendet, wenn Zelllinien nicht vorhanden sind. , Blutgewinnung erfordert jedoch eine ausgebildete phlebotomist und Blut eine kürzere Halbwertszeit als Speichel 1 hat. DNA aus Speichel ist weniger teuer und leichter zu erhalten, da sie gesammelt und durch die Mail ohne die Notwendigkeit für eine Blutentnahme, wodurch die Versuchsperson Bäder weit über den Einzugsbereich der Krankenhäuser und Laboratorien 2. Studienaufnahme kann verbessert werden, wenn die Probanden die Möglichkeit zu geben eine Speichelprobe statt Blut 3, 4. Können Bedenken hinsichtlich der Quantität und Qualität der DNA aus dem Speichel seine weit verbreitete uns eingeschränkt habenTrotz zahlreicher Studien neueren Studien, die die Eignung der gesamte Speichel, mit einem Durchschnitt von 4,3 x 10 5 Zellen pro Milliliter, zum DNA-Test gegenüber den älteren Tupfern Verfahren, die signifikante Mengen an Speichel 2, 3, 4, 5 nicht erhalten hat e, 6. Während eine bescheidene Literatur existiert, die die Eignung der Gesamtspeichel abgeleiteten DNA für die Genotypisierung Anwendungen wie Microarray-basierte Methoden 8, 9, 10, keine Studien haben untersucht, Next Generation Sequencing (NGS). Das Ziel für die Optimierung dieses ganze Speichel DNA Extraktionsprotokoll war es, Menge und Qualität für Anwendungen in der Genetik einer kosteneffektiven Weise, die leicht in Labore mit gemeinsamen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien umgesetzt zu maximieren.
DNA-Extraktion aus Speichel erfordert mehrere Verfahren: 1) Sammlung und Lagerung, 2) Zell-Lyse, 3) RNase-Behandlung, 4) Proteinfällung, 5) Ethanol-Fällung, 6) DNA Rehydrierung. Die DNA-Stabilisierungspuffer-Lösung, beschriebenvorher 2, Funktionen angemessen unverändert. Kein Versuch zur Optimierung der RNase-Behandlung und DNA Rehydratisierung Schritte wurde. Für jeden weiteren Schritt wurden mehrere Variablen, die Rendite auswirken könnten identifiziert. Jede Variable wurde einzeln manipuliert und Verbesserung der Ausbeute und Qualität wurde statistisch ausgewertet. Für Variablen, die gezeigt wurden, um die Ausbeute und / oder DNA-Qualität zu verbessern, wurden die optimalen Werte in der letzten Protokoll enthalten.
Das vorliegende Verfahren ist eine optimierte DNA-Extraktionsprotokoll, die deutlich verbesserte Ausbeute von hochmolekularer DNA im Vergleich zu Standardmethoden, ohne dabei DNA-Qualität. Der entscheidende Schritt mit der größten Wirkung auf den Ertrag die meisten war Schritt 5.2, die eine längere Zentrifugation Schritt während Ethanol-Fällung als jeder veröffentlichten Protokoll hier, überprüft mit einer Ausnahme, die nicht weit verbreitet war 11 umfasst. Keine Änderungen in der DNA-Qualität mit …
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
Proteinase K | Sigma | P6556 |
Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
Isopropanol | Fisher | A416-4 |
Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
NaCl | Fisher | AC194090010 |
Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
Equipment | ||
Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |