Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
Получение высокого качества ДНК для генетических исследований человека имеет важнейшее значение в процессе обнаружения гена болезни. Кровь, при том, что требует инвазивных процедур, а также быть более дорогим, чем сбора слюны, способствует для создания линии иммортализованных клеток в виде бесконечного источника ДНК, или токов для функциональных исследований, а иногда и ДНК в крови используется, когда клеточные линии не доступны. Однако получение кровь требует квалифицированного Phlebotomist и кровь имеет короткий период полураспада, чем слюны 1. ДНК из слюны дешевле и легче получить, так как он может быть собран и отправлен по почте без необходимости Phlebotomist, тем самым увеличивая потенциальные бассейны, подлежащих далеко за пределы водосборного бассейна больниц и лабораторий 2. Исследование учащихся может быть улучшена, если объекты имеют возможность давать образец слюны вместо крови 3, 4. Опасения по поводу количества и качества ДНК из слюны, возможно, ограничивается его широкое насэ несмотря на многочисленные исследования последних исследований, показывающих, пригодность всей слюны, в среднем 4,3 х 10 5 клеток на миллилитр, для анализа ДНК за старые методы буккальные тампоны, которые не получить значительное количество слюны 2, 3, 4, 5, 6. Пока скромный литература существует показывая пригодность всей слюны, полученной ДНК для генотипирования приложений, включая микрочипов на основе методов 8, 9, 10, никакие исследования не рассматриваются следующего поколения секвенирования (NGS). Цель оптимизации всю эту протокола экстракции слюны ДНК была максимально количество и качество для генетики приложений в экономически эффективным образом, что легко реализуется в лабораториях с обычных реагентов и расходных материалов.
Выделение ДНК из слюны требуется несколько процедур: 1) сбор и хранение, 2) лизис клеток, 3) лечение РНКазы, 4) осаждение белка, 5) осаждение этанолом, 6) регидратации ДНК. Раствор ДНК стабилизации буфера, описанныеранее 2, функции адекватно без изменения. Не было сделано никаких попыток оптимизировать лечение РНКазы и шаги ДНК регидратации. Для каждого из оставшихся шагов, были выявлены несколько переменных, которые могут повлиять выход. Каждая переменная манипулировали индивидуально и улучшение урожайности и качества оценивали статистически. Для переменных, которые были показаны для повышения урожайности и / или качество ДНК, оптимальные значения были включены в итоговый протокол.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящая процедура оптимизирована протокол выделения ДНК, что значительно улучшилась урожайность высокомолекулярной ДНК веса по сравнению со стандартными методами, без ущерба для качества ДНК. Решающим шагом с самым большим влиянием на выход большей была шагом 5.2, которая включает ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Riferimenti
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
