Insamling och Utvinning av saliv-DNA för nästa generations sekvense
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
Att få hög kvalitet DNA för genetiska studier är viktigt i sjukdomsgenen forskningsprocessen. Blod, även om det krävs en invasiv förfarande och dessutom vara dyrare än saliv samling, är att föredra för att skapa odödliga cellinjer som en oändlig källa av DNA, eller iPSCs för funktionella studier, och ibland blod DNA används när cellinjer är inte tillgängliga. Men att få blod kräver en utbildad phlebotomist och blod har en kortare halveringstid än saliv 1. DNA från saliv är billigare och lättare att få, eftersom det kan samlas in och skickas via post utan att det behövs en phlebotomist och därigenom öka potentiella ämnes pooler långt utanför upptagningsområdet för sjukhus och laboratorier 2. Studie inskrivning kan förbättras när individer har möjlighet att ge ett salivprov i stället för blod 3, 4. Oro över kvantitet och kvalitet av DNA från saliv kan ha begränsat sin utbredda osse trots många studier nya studier som visar lämplighet hela saliv, med ett genomsnitt på 4,3 x 10 5 celler per milliliter, för DNA-testning framför de äldre buckala kompresser metoder som inte beviljats betydande mängder saliv 2, 3, 4, 5, 6. Även en blygsam litteraturen existerar visar lämplighet hela saliv härlett DNA för genotypning tillämpningar, inklusive microarray-baserade metoder 8, 9, 10, har inga studier undersökt nästa generations sekvensering (NGS). Målet för optimering hela denna saliv DNA-extraktion Protokollet var att maximera kvantitet och kvalitet för genetik applikationer på ett kostnadseffektivt sätt som lätt genomförs i laboratorier med vanliga reagens och förbrukningsvaror.
DNA-extraktion från saliv kräver flera förfaranden: 1) insamling och lagring, 2) cellysering, 3) RNas behandling, 4) proteinutfällning, 5) etanolutfällning, 6) DNA rehydrering. DNA Stabilization Buffertlösning, beskriventidigare 2, fungerar tillfredsställande sätt utan ändring. Inga försök att optimera RNas behandling och DNA rehydrering steg gjordes. För varje återstående steg har flera variabler som kan påverka avkastningen identifieras. Varje variabel manipulerades individuellt och förbättrad avkastning och kvalitet bedömdes statistiskt. För variabler som visades för att förbättra avkastningen och / eller DNA-kvalitet, de optimala värden som ingår i det slutliga protokollet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande förfarandet är en optimerad DNA-extraktion protokoll som har förbättrats avsevärt utbytet av högmolekylära DNA jämfört med standardmetoder, utan att kompromissa med DNA-kvalitet. Det kritiska steget med störst påverkan på avkastningen mest var steget 5.2, som innehåller en längre centrifugeringssteg under etanolprecipitation än någon publicerat protokoll omdömet här, utom en som inte fick stor spridning 11. Inga förändringar i DNA-kvalitet i samband med detta längre centrifu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Riferimenti
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
