En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
Verkrijgen van hoge kwaliteit DNA voor menselijke genetische studies is essentieel in de ziektegen ontdekkingsproces. Blood, maar die een invasieve procedure en ook duurder dan speeksel collectie, de voorkeur voor het maken geïmmortaliseerde cellijnen als een onuitputtelijke bron van DNA of iPSCs voor functionele studies en soms bloed DNA wordt gebruikt wanneer cellijnen beschikbaar. Echter, het verkrijgen van bloed vereist een getrainde phlebotomist en bloed heeft een kortere halfwaardetijd dan speeksel 1. DNA van speeksel is goedkoper en gemakkelijker te verkrijgen, omdat het kan worden opgehaald en verzonden via de mail zonder de noodzaak van een phlebotomist, waardoor de potentiële proefpersoon zwembaden ver buiten het stroomgebied van ziekenhuizen en laboratoria 2. Studie inschrijving kan worden verbeterd wanneer proefpersonen de mogelijkheid van het geven van een speeksel monster in plaats van bloed 3, 4. Zorgen over de kwantiteit en kwaliteit van het DNA uit speeksel kunnen hebben beperkt het wijdverbreide onse ondanks talrijke studies recente studies die de geschiktheid van speeksel, met een gemiddelde van 4,3 x 10 5 cellen per milliliter, voor het testen van DNA via oudere speekselmonsters methoden waarbij geen significante hoeveelheden speeksel 2, 3, 4, 5 hebben verkregen, 6. Terwijl een bescheiden literatuur bestaat die de geschiktheid van de hele speeksel afgeleide DNA voor genotypering toepassingen, waaronder-microarray gebaseerde methoden 8, 9, 10, geen studies hebben onderzocht next generation sequencing (NGS). Het doel voor het optimaliseren van deze hele speeksel DNA-extractie protocol was om kwantiteit en kwaliteit voor de genetica toepassingen te maximaliseren in een kosteneffectieve manier die gemakkelijk wordt uitgevoerd in laboratoria met gemeenschappelijke reagentia en verbruiksgoederen.
DNA-extractie van speeksel vereist een aantal procedures: 1) het verzamelen en opslaan, 2) cellysis, 3) RNase behandeling, 4) eiwitprecipitatie, 5) ethanolprecipitatie, 6) DNA rehydratatie. De DNA Stabilization Buffer oplossing, beschrevenvoorheen 2, adequaat functioneert zonder wijziging. Geen poging de RNase behandeling en DNA stappen rehydratatie optimaliseren gemaakt. Voor elke stap die nog overblijft, werden verschillende variabelen die van invloed kunnen de opbrengst geïdentificeerd. Elke variabele werd individueel gemanipuleerd en verbetering van opbrengst en kwaliteit werd statistisch onderzocht. Voor variabelen die werden naar opbrengst en / of DNA te verbeteren, worden de optimale waarden in de definitieve protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze procedure is een geoptimaliseerde DNA-extractie protocol aanzienlijk verbeterd rendement van hoog moleculair gewicht DNA vergeleken met standaard werkwijzen, zonder dat DNA kwaliteit. De kritische stap met het grootste effect op de opbrengst van de meest was stap 5.2, die een langere centrifugatiestap tijdens ethanolprecipitatie dan elke gepubliceerde protocol hier beoordeeld, behalve een die niet op grote schaal werd verspreid 11 bevat. Geen veranderingen in DNA kwaliteit waaraan deze langere centrifuga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Riferimenti
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
