Abstract
התקדמות משמעותית נעשתה בקביעת המנגנון של עריכת רנ"א המיטוכונדריה בtrypanosomes. בדומה לכך, התקדמות ניכרת נעשתה בזיהוי הרכיבים של מתחם editosome כי לזרז עריכת רנ"א. עם זאת, זה עדיין לא ברור כיצד חלבונים אלו לעבוד יחד. תרכובות כימיות המתקבלות ממסך תפוקה גבוהה נגד editosome עלולות לחסום או להשפיע שלב אחד או יותר במחזור העריכה. לכן, זיהוי של תרכובות כימיות חדשות יפיק בדיקות מולקולריות רבות ערך עבור לנתח את פונקצית editosome והרכבה. במחקרים קודמים, במבחני חוץ גופית עריכה בוצעו באמצעות RNA שכותרתו רדיו. מבחני אלה הם זמן רב, לא יעיל ואינם מתאים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, המבוסס על הקרינה הומוגני "לערבב ולמדוד" פטיש ribozyme במבחנה assay כתב לפקח על עריכת רנ"א, מוצג. רק כתוצאה של עריכת RNA שלribozyme פטיש מצע oligoribonucleotide תהודה העברת אנרגיית הקרינה (סריג) עובר מחשוף. זה בתורו גורם להפרדה של fluorophore מהמרווה ובכך לייצר אות. לעומת זאת, כאשר פונקצית editosome היא עצורה, אות הקרינה תהיה הרווה. זה assay רגיש והפשוט ביותר שצריכה להיות באופן כללי החלים על לפקח בעריכת RNA חוץ גופית או הקרנת תפוקה גבוהה של כימיקלים שיכולים לעכב את פונקצית editosome.
Introduction
תהליך עריכת רנ"א, שינוי mRNA לאחר תעתיק, התגלה לראשונה בtrypanosomatids 1. מאז, עבודה משמעותית כבר נערכה בלומדת את המנגנון עומד מאחורי עריכת רנ"א בTrypanosoma brucei 2,3. בסדרה של תגובות אנזימטיות, editosome, מורכב ליבה של כ 20 חלבונים, יוצר mRNAs המיטוכונדריה הבוגר לרכיבים מרובים של מערכת זרחון חמצוני להפקת אנרגיה. סדר אירועי קטליטי הוא מחשוף endonucleolytic, uridylate בנוסף (U) או מחיקה, וקשירה, כפי שהוכתב על ידי RNAs מדריך (gRNAs) 4.
בנוסף לחלבוני editosome המורכבים הליבה, מספר גורמי אבזר יש גם זוהה 5-7. חלבונים אלה נראים בעיקר מקובצים במתחמים עצמאיים. עם זאת, את סדר ההרכבה חלבון במתחם editosome הליבה ודפוסי האינטראקציה של מתחם הליבה עם האבזרמתחמים הם עדיין לא נקבעו. מיקוד תהליך עריכת רנ"א בtrypanosomatids עשויה לספק dissectors הכימי המסייעים בלימוד ההרכבה והתפקוד של מתחם editosome. יתר על כן, מחקרים תפקודיים בכמה חלבוני editosome הראו חיוניות פני שלבי חיים שונים, המצביע על הפוטנציאל שלהם כתרופת מטרות 8-12. לכן, מעכבים מצאו של editosome יכולים גם לפעול כתרכובות עופרת נגד trypanosomatids. זה זמן, כמו תרופות הקיימות כיום נגד מחלות הנגרמות על ידי trypanosomatid הן רעילות, לא יעילות ויקרות 13,14.
Assay יעיל ונוח במבחנה יש צורך לחקור את היקום הכימי למעכבים ספציפיים שחוסמים עריכת רנ"א. שלושה מבחני פותחו ומשמשים לניטור פעילות editosome: (א) עגול מלאה בassay עריכת רנ"א המבחנה 15, (ב) לפני שהבקיע בassay עריכת רנ"א המבחנה 16,17,nd (ג) ribozyme פטיש (HHR) מבוסס assay 18. שני מבחני הראשונים מסתמכים על הדמיה ישירה של המוצר בעריכה (ATPase 6 mRNA) עם העזרה של קרינה רדיואקטיבית. Assay מבוסס HHR משתמש בגרסה שונה של mRNA ATPase 6 שהוא מודל להתנהג כribozyme על עריכה. Ribozyme הפונקציונלי אז דווקא דבק מצע RNA רדיואקטיבי, המשרת ככתב. לאחרונה, Moshiri et al. פיתח 'לערבב ולמדוד "מבוסס HHR בassay כתב מבחנה כדי לפקח על עריכת RNA שבו מצע RNA רדיואקטיבי מוחלף בהעברת תהודה הקרינה אנרגיה (סריג) מצע 19. יתרונות העיקרון של assay זה הם: (א) זה הוא שילוב מהיר ונוח וסוג המידה של assay, כמו הייצור של ribozyme הפעיל ומחשוף מצע מתרחש בו זמנית באותו הצינור בנפח נמוך (כלומר 20 μl), (ב רגישות) זה ימנע את השימוש בחומרים שכותרתו רדיואקטיבית, (ג) שהואfforded ידי מכשור הקרינה בפורמט צלחת מייקר כייל, ואות גבוהה יחס רעש (ד). שימוש assay זה, ההשפעה של מעכבים ידועים RNA עריכת האנזים נגד editosome מטוהר אושרה 19. ניסוי זה תוקף את assay לזיהוי מהיר של מעכבי עריכת רנ"א, בעיקר נגד editosomes השלם מט brucei.
איור 1 הוא סכמטי צעד אחר צעד מפורט של בassay עריכת רנ"א מבחנה הקרינה מבוסס. פרוטוקול זה יכול לשמש לניטור עריכת RNA במבחנה או בקלות להיות מותאם להקרנת ספריות מתחם של קני מידה שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול שלהלן מתאר את ההליך לביצוע assay עריכת RNA המבוסס על הקרינה. Assay יכול להתבצע בצינור PCR יחיד, 96 היטב, או צלחות תלוי בהיקף של הניסוי 384 גם. בהמשך לכך אות הקרינה ניתן לקרוא במערכת איתור PCR בזמן אמת מתאימה. Assay כאן מתואר בהקשר של צלחות 384 גם.
1. Culturing ט תאי brucei
- הכן את מדיום גידול לט brucei procyclic תאי טופס. עבור 1 ליטר של מדיום:
- לפזר אבקת SDM-79 25.4 גרם במי 800 מיליליטר miliQ.
- הוסף 2 גרם של NaHCO 3 וה-pH ל 7.3 עם 10 M NaOH.
- מוסיף מים nanopure לנפח סופי של 900 מיליליטר, לסנן לעקר.
- להוסיף סרום שור עוברי (FBS), פתרון וhemin (2.5 מ"ג / מיליליטר) פניצילין, סטרפטומיצין לריכוזים סופיים של 10% (V / V), 100 U / ml ו7.5 מ"ג / ליטר בהתאמה.
- לגדול 300 מיליליטר של ט <em> סוג 1.7A brucei פראי (טופס procyclic) תאים ב28 ° C, רועד בסל"ד 70 לצפיפות של 1.5 x 10 7 תאים / מיליליטר. הערה: זה אמור לייצר 3 מיליליטר של editosome הפעיל עם ~ 0.5 מ"ג של חלבון סך הכל, מספיק ל600 תגובות עריכה.
- קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב6,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.
- שטוף את הכדור עם 50 מיליליטר של חיץ PBSG המקורר (10 מ"מ Na 2 HPO 4, 10 מ"מ אא 2 PO 4, 145 mM NaCl, ו6 גלוקוז מ"מ), וספין למטה התאים שוב על ידי צנטריפוגה ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.
2. בידוד של גולמי המיטוכונדריה
הערה: יש לבצע את כל הצעדים על קרח או על 4 מעלות צלזיוס לשמר editosome פעילות.
- Resuspend התאים שנקטפו ב30 מיליליטר של חיץ DTE (1 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 ו1 mM EDTA). השתמש homogenizer 40 מיליליטר סטרילי Dounce (טרום צונן) לשבש את קרום התא על ידי מלטף את מעלה ומטה לפחות 10 פעמים על קרח. מייד להוסיף סוכרוז 4.3 מיליליטר של 60% (w / v, כלומר 1.75 ז) לhomogenate לריכוז סופי של 0.25 מ צנטריפוגה ב XG 15,800 עבור 10 דקות ב 4 ° C, כדי להפיל מעדיף מיטוכונדריה.
- Resuspend את כדור המיטוכונדריה ב4.6 מיליליטר של חיץ STM (20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 250 סוכרוז מ"מ ו 2 מ"מ MgCl 2). הוספת 13.8 μl של 0.1 M CaCl 2 ו -4 μl של DNase RNase ללא לריכוזים סופיים של 0.3 מ"מ ו -9 U / ml, בהתאמה. דגירה את התערובת במשך שעה 1 על קרח.
- הוספת 4.6 מיליליטר של חיץ STE (20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, סוכרוז 250 מ"מ ו2 mM EDTA) כדי להשבית DNase I. צנטריפוגה ב XG 15,800 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend את הכדור ב400 μl של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס-HCl pH 7.2, 10 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ KCl, 1 מיקרוגרם / מיליליטר pepstatin, 1 מ"מ DTT, ומעכבי פרוטאז 1x שלמים ללא EDTA) והעברה ל צינור microfuge.
- הוסף 10% טריטון X-100 לריכוז סופי של 1% nd דגירה lysate ל15 דקות ב 4 ° C על הכתף צינור.
- נקה את lysate המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה פעמיים ב17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C; שמירה על supernatant פינה בכל פעם.
3. Editosome טיהור
- יוצקים 10 מיליליטר 10% -30% (v / v) גליצרול שיפוע ליניארי (טבלה 1) בצינור ultracentrifuge באמצעות חיץ שיפוע 2x hhe (40 HEPES מ"מ pH 7.9, 20 מ"מ Mg (OAC) 2, 100 מ"מ KCl, ו 2 mM EDTA) ומכונת שיפוע על ידי ביצוע הוראות במדריך.
- מוציא בזהירות 500 μl של פתרון מהחלק העליון של שיפוע גליצרול ועדינות לטעון 500 μl של lysate המיטוכונדריה פינה. ספין על 178,000 XG במשך 6 שעות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות ultracentrifuge.
- לאסוף 500 שברים μl ברצף מהחלק העליון לחלק התחתון של השיפוע ב 4 ° C. לאחר מכן הצמדתי להקפיא את השברים באמצעות חנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד שימוש.
s = "jove_title"> 4. RNA הכנה
- לחשל את תבנית ה-DNA המתאימה המכילה רצף משלים רצף אמרגן T7 (טבלה 2) עם oligonucleotide אמרגן T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ") ביחס טוחנת 1:01 על ידי חימום ב90 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות וקירור ב RT לפחות 10 דקות.
- לתמלל RNA באמצעות ערכת שעתוק במבחנה על ידי ביצוע הוראות במדריך.
- עצור את תגובת השעתוק על ידי הוספת נפח שווה של 7 M צבע אוריאה (שתנן 7 M, 0.05% Cynol קסילן, ו0.05% bromophenol כחולים). לרוץ על מסנן מעוקר 9% denaturing ג'ל polyacrylamide (acrylamide 9%, 7 M אוריאה, 1x TBE).
- השתמש בהצללת אולטרה סגול (UV) עם מנורת UV בגלים קצרים כדי לאתר וRNA בהתאמה בלו. מניחים את חתיכת ג'ל נכרתה בצינור microfuge ולהוסיף 400 μl של חיץ elution ג'ל (20 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 250 מ"מ NaOAc, 1 mM EDTA ו0.25% SDS). Elute הלילה בשעה RT על הכתף צינור.
- Precipitate RNA eluted על ידי הוספת 1 מיליליטר של אתנול 100% קרים ודוגר גם ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- צנטריפוגה ב XG 16,000 ל30 דקות ב 4 ° C, כדי גלולה למטה RNA.
- שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 75% אתנול. צנטריפוגה ב XG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend את כדור RNA כראוי במי RNase ללא כדי להשיג את הריכוזים הרצויים, כפי שמוצג בטבלה 2.
5. Assay RNA עריכת הקרינה מבוססת
- לתגובה אחת, לשלב pmol 1 (μl 1) של preA6Rbz ו2.5 pmol (μl 1) של gA6Rbz (יחס טוחנת 1:2.5) בצינור microfuge, לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולתת לו לשבת על RT במשך שעה לפחות 10 דקות.
- בינתיים מכין תערובת הורים באמצעות טבלה 3, ללא preA6Rbz וgA6Rbz, לתגובת העריכה המכילה חיץ 1x hhe (25 HEPES מ"מ pH 7.9, 10 מ"מ Mg (OAC) 2, 50 מ"מ KCl ו10 mM EDTA), 1 מ"מה-ATP, 5 מ"מ CaCl 2, 16 ng / μl של RNA Torula שמרים, 0.1% טריטון X-100, וeditosome המטוהרים.
- הוספת preA6Rbz annealed וgA6Rbz כדי להשלים את מיקס מאסטר.
- לוותר 18 μl של מיקס מאסטר (לוח 3) לתוך בארות המכילות גם 2 μl מים RNase חינם (בארות ללא תרכובות) או 2 μl של 200 תרכובות כימיות מיקרומטר וכולל דגימות שליטה בצלחת על פי איור 5.
- חותם את הצלחת עם אוטם צלחת ומסובב את הצלחת, כדי להסיר כל בועות אוויר. לדגור על C ° 28 במשך 4 שעות.
- הוסף 25 pmol (2 μl) של המתחרה gA6Rbz היטב כל אחד. הנח אוטם טרי, לסובב את הצלחת ומניח אותו על מכונה ה-PCR בזמן אמת. לתכנת את הניסוי הבא:
שלב 1: 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; שלב 2: 24 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; שלב 3: להפסיק. - הוסף 15 pmol (μl 1) של מצע סריג היטב כל אחד לנפח סופי של μl 23. חותם את הצלחת עם אוטם טרי.מהירות לסובב את הצלחת ומניח אותה בחזרה במכונה ה-PCR בזמן אמת.
- תכנית ניסוי חדש בשלבים הבאים:
שלב 1: 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; שלב 2: קראו; שלב 3: עבור לשלב 1, 40 פעמים; שלב 4: להפסיק. - התקנת הצלחת על ידי בחירת כל הבארות הדורשות קריאה ולבחור את מסנן FAM. קלט נפח כמו 23 μl ולהתחיל לרוץ.
- לחשב את השיפוע של הערכים המתקבלים מכל טוב / מדגם להשיג מדידה קינטית על ידי התוויית המדרונות על גרף עמודות לצורך הניתוח. הערה: קריאה הקינטית משפרת את יחס אות לרעש בין המדגם והרקע; כמדגם הרקע יהיה מדרון קרוב לאפס. יש קריאת נקודת סיום רעש רקע גבוה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים הנדרשים להקמת מסך בקנה מידה גדולה בכל הצעדים הדרושים, איורים 2-5 הם ניסויי שליטת נציג הקשורים לאיכות של assay. אלה הם ניסויי שליטה חיוניים לassay עקבי על פני כמה ימים של הקרנה או להשוואה בין מסכים שונה.
הערכת יחס אות לרעש הקרינה
על מנת להבטיח את היציבות והאיכות של מצע oligoribonucleotide שכותרתו והעמסת בהתקנה בקנה מידה גדולה, Z'גורם, מוגדר כהפרש בין רקע assay והאות המרבית חושבה באמצעות מולקולת ribozyme הפעילה (A6Rbz). . מבחני עם Z'גורם> 0.5 נחשבים מקובלים עבור מסך תפוקה גבוהה איור 2 מראה נתונים נציג באמצעות מצע סריג שכותרתו עם 5 'והעמסת (FAM; פולט) ו 3' N, N '-tetramethylrhodamine (טמרה; מרווה) (A6Rbz_F / T). מצע זה מיוצר גורם Z'של 0.64 כאשר מחושב באמצעות 72 משכפל בנוכחות והיעדר A6Rbz.
ב assay זה מצע חלופי באמצעות מרווה איווה שחורה כהה (A6Rbz_F/Ib) יכול להניב יחס אות לרעש טוב יותר בהשוואה לטמרה. זאת, משום שאיוותה שחור, שלא כמו טמרה, פולט ספג אנרגיה בצורה חום ולא אור. Z'הגורם שהושג באמצעות FAM / איווה שחור (F / Ib) שכותרתו היה מצע 0.68. השיפור בגורם Z'למצע שכותרתו Ib F / מעל מצע שכותרת טמרה הוא בגלל הרקע הנמוך יחסית שלה. תוצאות נציג אלו מראות כי שני מצעי אפשרויות מעשי לשימוש במסך תפוקה גבוהה.
קביעת עריכת הפעילויות של השברים Gradient גליצרול
כדי לקבוע ובחר את השברים editosome הפעילים ביותר לניסויים, glycero שברים שיפוע l נבדקו לעריכה במבחנה באמצעות assay הקרינה מבוססת (שלב V). נתונים אלו מראים (איור 3) שברים 7-12 כמו שברים הפעילים ביותר (≥ פעילות עריכת 50%; עם החלק הפעיל ביותר כמו 100%). ניתן לשלב שברים אלה כאשר נדרשים יותר editosome.
חישוב Z'הגורם כאשר שברי Editosome אוחדו
כדי לקבוע את ההשפעה של combinig שבריר editosome, ערך Z'-הפקטור של 0.6 חושבו כאשר השברים הפעילים ביותר (+ F10 + F9 F8) שימשו כמקור editosome. כדי לחשב את Z'הגורם 72 משכפל נבדק בנוכחות והיעדר editosome (איור 4). מצע F / Ib היה בשימוש בניסוי זה. נתונים אלו מראים כי בהתבסס על Z'הגורם, המשלב את השברים שיפוע גליצרול יש השפעה מינימאלית על האיכות של assay.
ass = "jove_content"> ניסוי נציג בקרה עבור assay
נציגי נתונים השוואת דגימות בקרה שונות שימשו כדי לנתח את המשתנים בassay. כפי שניתן לראות בתרשים 5, תגובות חסרות כל רכיבי RNA עריכה (תגובות 1-4) לא דבק המצע. מחשוף של המצע כפי שהיא נמדדת על ידי פעילות עריכת הקרינה ויחסית הוא ציין רק בנוכחות של כל הרכיבים מתגובות העריכה בהעדר מעכב (תגובה 5) או בנוכחותם של כל רכיבי העריכה ומתחם פעיל (תגובה 6). בניגוד לכך, מתחם מעכב יכול לחסום עריכת רנ"א, והוא משמש כביקורת חיובית (תגובה 7). הנה, שחור עוקץ (MRB) ותרכובות .5.3 שימשו כביקורת החיובית ושלילית, בהתאמה.
"Width =" ghres.jpg 500 "/>
איור 1. Hammerhead בassay עריכת רנ"א מבחנה מבוסס ribozyme. א) ייצוג סכמטי שלב אחר שלב של בassay עריכת המבחנה הקרינה מבוסס: (א) הכלאה של ribozyme הפטיש נערך מראש (A6Rbz נערך מראש) עם RNA המדריך שלה (gA6Rbz). (ב) הכרה ואינטראקציה של הדופלקס רנ"א ידי מורכב editosome המטוהרים. עריכה (ג) מחיקת RNA זרזה ידי editosome. (ד) דיסוציאציה של A6Rbz נערך מeditosome וgA6Rbz על ידי חימום ב85 ° C ותוספת של מתחרה מדריך RNA (gA6Rbz_comp). (ה) הכלאה של מצע סריג עם ribozyme הפעיל A6 הפטיש (A6Rbz הפעיל). (ו) זיהוי של אותות FAM הבאים מחשוף של מצע סריג ידי ribozyme הפעיל. B) ribozyme נערך מראש הפטיש (לפני עריכה-A6Rbz) מוצג בשיתוף עם gA6Rbz המציין את מחיקתם של שלושה קשר (arro בעל שני הראשיםw) מאתר העריכה (ES). כתוצאה מכך של עריכת רנ"א בנוכחות editosome הפונקציונלי ribozyme פעיל נערך לצורה הפעילה שלה (A6Rbz עריכה) שיכול כעת לדבוק מצע סריג (אתר מחשוף שמסומן על ידי חץ). נשמרים 5'-CUGA-3 'של A6Rbz נערך בליבת קטליטי חיונית לפעילות ribozyme (אתר בעריכה) מודגש (נתון זה שונה מMoshiri 19). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אות לרעש השוואת יחס בין מצעי סריג מחסה quenchers שונה. פעילות ribozyme (A6Rbz) באמצעות FAM / טמרה (F / T) וFAM / איווה FQ השחור (F / Ib) מצעים. Represe ציר ה-Yיחידת הקרינה NTS שרירותית (FAU) לדקה.
איור 3. פעילות עריכת RNA של שברים בחרו מתקבלים מצנטריפוגה שיפוע גליצרול של lysate המיטוכונדריה. חלק # 9 (F9) יש הפעילות הגבוהה ביותר. ציר y מייצג את פעילות עריכה היחסית באחוז, בהתחשב F9 כ100%.
איור 4. חישוב Z'גורם באמצעות השברים הפעילים ביותר (F10 + F9 + F8) כמקור editosome. וריאציה ניסויית הושגה מ72 משכפל של כל סוג של תגובה. Z'גורם חושב כ0.6. ציר y מייצג את פעילות עריכה היחסית.
איור 5. ניסוי נציג עבור assay עריכת RNA המבוסס על הקרינה. תגובות בוצעו בנפח סופי של μl 20 למערכת איתור בזמן אמת PCR CFX384 TouchTM היטב, ושימש למדידת אות הקרינה. הגרף מציג את הפקדים שונים, בנוסף לתגובת עריכה מלאה המכילה את כל הרכיבים עבור assay (# 5). הקרינה נמדדה בנוכחות מצע סריג לבד (# 1) על מנת להעריך את היושרה של המצע. דוגמא # 2 בוצע בהעדר editosome לעקוב אחר כל פעילות ribozyme לפני העריכה. כדי להעריך את ההשפעה של editosome מפוגל על פני המצע, הקרינה נמדדה בנוכחות editosome ומצע סריג בלבד (# 3). כדי לבדוק את הספציפיות עריכה מכוונת מדריך, סם ple בהעדר gA6Rbz שימש (מס '4). שאינו מעכב (.5.3, # 6) ומתחם מעכב (MRB, # 7) שימשו כדי לבדוק את ההשפעה על assay העריכה. בעת עריכת RNA היא מעוכבת באופן משמעותי על ידי MRB, יש השפעה זניחה של כ .5.3. הברים השגיאה מתאימות לוריאצית ניסוי (סטיית התקן) בין 10 משכפל. ציר y מייצג את פעילות עריכה היחסית באחוזים, בהתחשב בתגובה המלאה (מס '5) כ100%.
| 10% | 30% | |
| חיץ שיפוע 2x hhe | 5 מיליליטר | 5 מיליליטר |
| גליצרול | 1 מיליליטר | 3 מיליליטר |
| DEPC H 2 O | 4 מיליליטר | 2 מיליליטר |
| 1 M DTT | 10 μl | 10 μl |
לוח n-page = "תמיד"> 1. 10% & 30% פתרון גליצרול (10ml כל אחד).
| Ribozyme A6 טרום ערוך (preA6Rbz) | |
| תבנית preA6Rbz DNA | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCA TCAAAAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTT CC CCCTATAGTGAGTCGTATTA -3 " |
| preA6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUUUUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGA 'UCAAAUGU-3 |
| קונצרט כלשהו מניית RNA. | 1 מיקרומטר |
| מדריך A6 ribozyme (gA6Rbz) | |
| תבנית gA6RBz DNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAATAATTATCATATCACTGT CAAGGGAAAGTTGTGAGGGTGATGAGTCCGTGTATATCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 " |
| gA6Rbz RNA | 5'-GGGAUAUACACGGACUCAUCACCCUCACAACUU UCCCUUGACAGUGAUAUGAUAAUUAUUUUUUUUUUUUUUUUU-3 " |
| קונצרט כלשהו מניית RNA. | 2.5 מיקרומטר |
| מתחרה המדריך A6 ribozyme (gA6RBz_comp) | |
| תבנית gA6Rbz_comp DNA | 5'-GGATATACACGGACTCATCACCCTCACAACTTTC CCTTGACAGTGATATGATAATTATTTTTTTTTTTTTTTTT CCCTAT AGTGAGTCGTATTA -3 " |
| gA6Rbz_comp RNA | 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAUAAUUAUCAUAUCACUG 'UCAAGGGAAGUUGUGAGGGUGAUGAGUCCGUGUAUAUCC-3 |
| קונצרט כלשהו מניית RNA. | 12.5 מיקרומטר |
| פעיל A6 ribozyme (A6RBz) | |
| A6Rbz תבנית ה-DNA | 5'-ACATTTGATCTATTGTTTCGTCCTCACGGACTCAT CAGTCACAACTTTCCCTTTCTCTCCTCCCCCTAACCTTTCC CC CTATAGTGAGTCGTATTA -3 " |
| A6Rbz RNA | 5'-GGGAAAGGUUAGGGGGAGGAGAGAAAGGGAAA GUUGUGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAUAGAUCA AAUGU-3 " |
| קונצרט כלשהו מניית RNA. | 1 מיקרומטר |
| סריג מצע | |
| מרווה טמרה | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-טמרה-3 "(Eurogentec) |
| מרווה איווה שחורה | 5'-FAM-GAUCUAUUGUCUCACA-איווה שחורים 3 "(IDT) |
| קונצרט כלשהו מניית RNA. | 15 מיקרומטר (לשניהם) |
טבלה 2. תבניות DNA ו-RNA מצעים.
| הרכב | עריכת תגובה (μl) |
| 10x hhe | 1.5 |
| 0.1 M CaCl 2 | 1 |
| 100 מ"מ ה-ATP | 0.2 |
| 10% TritonX-100 | 0.2 |
| 500 ng / μl RNA שמרי Torula | 1 |
| Editosome | 5 |
| O RNase H החופשי 2 | 7.1 |
| 1 מיקרומטר preA6Rbz | 1 |
| 2.5 מיקרומטר gA6Rbz | 1 |
| סך הכל | 18 |
לוח 3. הרכב תגובה ומיקס מאסטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת הקרנת תפוקה גבוהה רומן לזהות מעכבים נגד מורכב עריכת RNA של trypanosomes הוצגה, מתן כלי חדש לגילוי תרופות נגד מחלות הנגרמות על ידי trypanosomatids. assay ribozyme מבוסס סריג כבר נעשה שימוש נרחב למטרות שונות 20-22; עם זאת, יש לנו מנוצלים הקיבולת של assay ribozyme מבוסס סריג לניטור במבחנה של פעילות עריכת רנ"א 19. assay זה עלול להיות מותאם לסוגים אחרים של עריכת רנ"א באאוקריוטים, כגון עריכת החלפת נוקלאוטיד של RNAs קידוד גרעין של יונקים 23.
החידוש של assay זה הוא לא בהקמת מבחני ribozyme מבוסס סריג כשלעצמה, אלא בפיתוח שיטה שמשלבת טכניקה זו לassay עריכת רנ"א שניתן להקרנת תפוקה גבוהה של כימיקלים נגד editosome. יש השיטה מבוססת assay ribozyme מספר יתרונות על פני מסכי ותחת אחריםays כיום מנוצל למטרה זו. באופן ספציפי, את הטכניקה מציעה assay רגיש ולשעתק "לערבב-and-מידה" בהסתמך על מצע ניאון בניגוד לאחד רדיואקטיבי, ובכך הופך אותו מתאים להקרנת תפוקה גבוהה 19. ניטור בזמן אמת של אות הקרינה לאחר תוספת של המצע במקום אות נקודת סיום פשוטה עושה את זה ניתן לקבוע בצורה מדויקת יותר IC 50 ערכים של תרכובות assayed 19. יתר על כן, הוא מאפשר בדיקה של ההשפעות המעכבות של תרכובות על המתחם כולו editosome בניגוד לחלבונים רקומביננטיים בודדים. בהתחשב באופי הדינמי של אינטראקציות בתוך קומפלקסי חלבונים, ניתן להציע אותו כי שיטה זו מאפשרת זיהוי של מעכבים נגד editosome חלבונים בנציג מבחינה ביולוגית יותר הגדרת 24. בנוסף, מיקוד מורכב כולו editosome מספק הזדמנות פוטנציאלית לעצור את ההתקדמות של עריכת רנ"אבצעדים זמניים שונים שלא זוהה בעבר. לכן, הטכניקה תאפשר צוברת נקודת מבט טובה יותר לגבי אינטראקציות ופעילויות שהנן חיוניים לתהליך של עריכת רנ"א. גישה זו כבר מצאה להיות מוצלחת בעבר כפי שהודגמה על ידי הבהרה של הרכבה מורכבת הריבוזום פרוקריוטים ותפקוד ניצול אנטיביוטיקה, כגון viomycin ואריתרומיצין, מתנהג כמו מעכבים של 24,25 המורכב.
כדי להבטיח את סיומו המוצלח של השיטה, התאמות מסוימות בפרוטוקולים עשויות להיות נחוצות. ראשית, בחירה של שבריר התמצית הראוי שיפוע גליצרול המיטוכונדריה היא קריטית. הנה, שברים 7 עד 11, המקביל לאזור ~ 20S של השיפוע, הראה פעילות העריכה הגבוהה ביותר, עם חלק 9 מציג פעילות מקסימלית. למרות שהחלק הזה נבחר לכל הבדיקות שהוצגו, זה חיוני כדי לבדוק את כל השברים מראש על מנת להעריך שבפרהction פסגות פעילות העריכה. שנית, כדי לאמת את בחירת שבר, זה הוא קריטי כדי לבצע בדיקות ראשוניות כדי להעריך את יחס אות לרעש על ידי חישוב ערך Z'הגורם. אם חלוקה שיפוע נכונה המיטוכונדריה גליצרול התמצית הושלמה, Z'ערך של 0.6 יכול להיות מושגת. בשלב הבא, מומלץ להעריך מחדש את עוצמת התגובה של תמצית המיטוכונדריה הדרושה כדי להשיג פעילות עריכה מקסימלי באמצעות טיטרציה 19.
מגבלה חשובה של הטכניקה שהוצגה במאמר זה נוגעת לתהליך מייגע וגוזל זמן של חלוקה שיפוע גליצרול תמצית המיטוכונדריה שבו מורכב editosome מטוהרת 19. למרות חסרונות אלה, טכניקה זו הציעה מעדיף להשיג שברי editosome גולמיים נתון העלות הנמוכה שלה לעומת פוטנציאל תשואה, ובכך לסייג את זה ליישום להקרנת תפוקה גבוהה. לעומת זאת, בשיטות אחרות כגון TAP תג purification, אשר מסוגלים לתת שברים editosome מטוהרים יותר, הם מומלץ לנמוכים למבחני תפוקה בינוניים, כגון במקרה של מבחני משניים. יתר על כן, על מנת להבטיח השפעה מעכבת ספציפית של תרכובות, יש צורך לכלול בקרות כדי לבדוק אותם נגד הפעילות של ribozyme (A6Rbz) בהעדר editosome. יש לציין שמחקרים קודמים הדגישו כי שיטה זו עשויה להיות יעילה בחישוב ערכי IC50 לתרכובות כמו צבען בשל ההפרעה האפשרית בריכוזים גבוהים מתחם 19.
כדי להגדיל את הרגישות של טכניקת HTS הציגה, פיתוח assay מבוסס הקרינה דומה מעורב ribozyme נערך מראש מראש ביקע נוסף הוא מועיל. היכולת זו תאפשר לעקוף את צעד מחשוף endonucleolytic שער הגבלה זרז ידי endonucleases במתחם editosome. יתרון נוסף של assay שונה זה יהיה היישום ככלי מיון משנייםכדי לפקח על ההשפעה של מעכבים שזוהו דרך המסך הראשי בExoUase, TUTase ופעילות קטליטית קשירה. Assay המוצע כיום מוגבל לזיהוי של מעכבים נגד סוג המחיקה של עריכת רנ"א. לכן, כיוון לפנות יהיה השינוי של assay הוצג כדי לאפשר ניטור של תופעות מורכבות בסוג הכניסה של עריכת רנ"א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDM-79 Medium | Gibco by Life Technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 | heat inactivation at 55 °C for 1 hr |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1 kg | Life Technologies | AM9902 |
References
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T.
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A.
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
