التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين
Summary
توفر الفحص التركيز تشكيل طريقة واضحة لتقييم إمكانات تحويل من الجين الورمي مرشح.
Abstract
Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.
Introduction
الخلايا السرطانية يمكن تمييزها عن نظيراتها العادية من قبل مجموعة واسعة من التعديلات، من أنماط التعبير الجيني لepigenomics إلى تغيرات شكلية والتكاثري. ومن بين هذه الأخيرة، وخفض الاعتماد على المصل، وفقدان الاتصال (الكثافة) تثبيط، واقتناء الانتشار مرسى مستقل، وفي نهاية المطاف، القدرة على تكوين الأورام عند حقنه في الحيوانات، مؤشرات قابلة للقياس مفيدة التحول الخبيث 3. عدة في المختبر والمقايسات فيفو تم وضعها من أجل التحول الخلوي. في المختبر فحوصات تهدف إلى تحديد وقياس التغيرات في التشكل الثقافة (التركيز تشكيل فحص)، وديناميات الثقافة (معدل النمو والكثافة التشبع)، وعامل النمو (النمو في انخفاض المصل) أو مرسى (النمو في أجار لينة) المتطلبات. لا يزال المعيار الذهبي لتحديد طبيعة الخبيثة من نوع الخلية تشكيل الورم (xenografts) في حيوانات التجارب. ومع ذلك، رانه يكلف وطول من الدراسات في الجسم الحي لا تجعل لهم دائما مبررا كخطوة أولى التحقق من صحة أو فحص الجينات المسرطنة مرشح. على الرغم من عدم الفحص في المختبر يوفر تقييم واضح للإمكانات أنكجنيك من الجين، فإنها توفر نظرة ثاقبة إمكانات أنكجنيك التي قد تضييق المستقبل في الدراسات المجراة. واحد من أكثر الأنظمة المستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانات أنكجنيك في المختبر هو التركيز تشكيل الفحص 2. ويعتمد هذا الأسلوب على استخدام NIH 3T3 الخلايا الليفية الماوس، خط خلية غير حولت الذي يظهر تثبيط اتصال قوية. overexpression من على النتائج الجين الورمي في فقدان النمو التي تعتمد على كثافة. الخلايا تحولت يمكن بعد ذلك تنمو في طبقات متعددة، وتشكيل "بؤر"، تصور بسهولة ضد أحادي الطبقة الخلفية للخلايا غير متحول. تشكيل التركيز الفحص، ثم، يقيس قدرة الجين الورمي مرشح للحث على التحول الخبيث، كما يتضح من فقدان الاتصال inhibition باعتباره النمط الظاهري للقياس. وقد استخدم FFA لتقييم التحول من overexpression من تحركات البروتينات (على سبيل المثال، SRC 4، BRAF 5)، عوامل النسخ (على سبيل المثال، N-MYC 6) مستقبلات، إلى جانب G-البروتين (على سبيل المثال، P2RY8 7) وGTPases (على سبيل المثال ورأس 1)، وغيرها. السهولة النسبية لهذا الاختبار يجعلها خيارا جيدا من شأنها أن توفر إجابة واضحة وسريعة بصريا ما إذا كان overexpression من الجينات يكفي لتحويل NIH 3T3 خلايا فأر الليفية في المختبر.
وFFA الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم بلات-E خط الخلية التعبئة والتغليف 8، والذي يوفر البروتينات الفيروسية التعبئة والتغليف، وفيروسات ناقلات pBABEpuro 9 (Addgene بلازميد 1764) لإنتاج الفيروس الارتجاعي. بعد ترنسفكأيشن مع بناء pBABEpuro التي تحتوي على الجينات في المصالح، فإن خط الخلية بلات-E تنتج الارتجاعي ecotropic التي يمكن استخدامها لتصيب خلايا NIH 3T3. تيطريقة الفيروسي له من توصيل الجينات هو أكثر فعالية من الأساليب ترنسفكأيشن الكيميائية التقليدية، وأنه يوفر وسيلة للتعبير عن هذا الجين على نحو مستدام 10. مرة واحدة دمجها في جينوم الخلايا NIH 3T3، والدافع overexpression من هذا الجين من الفائدة من جانب يكرر محطة الطويلة الفيروسية (LTR) المروج 11. ويمكن استخدام هذا التعبير المستمر لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح والنشاط أنكجنيك، مقاسا تشكيل بؤر، على خلايا NIH 3T3.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر FFA طريقة سريعة وسهلة لتقييم التحول الخبيث في المختبر. فمن قابلة للفحص عدد كبير نسبيا من الجينات المرشحة، والمتطلبات التقنية المتواضعة جعلها فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من الجينات يمكن coexpressed (يشار إليها أحيانا باسم "التعاون" فحص)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من جديد مبتكر برنامج جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة في (ED). وأيد AA في جزء من الجوائز البكالوريوس من المعهد الوطني للسرطان ومؤسسة العلوم الوطنية.
Materials
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
Riferimenti
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. . Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5′ and 3′ long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
