Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen
Summary
De Focus Formation Assay verschaft een eenvoudige methode om de transformerende potentieel van een kandidaat oncogen beoordelen.
Abstract
Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.
Introduction
Tumorcellen kunnen worden onderscheiden van hun normale tegenhangers diverse wijzigingen van patronen van genexpressie te epigenomics morfologische en proliferatieve veranderingen. Onder de laatste, verminderde afhankelijkheid van serum, verlies van contact (dichtheid) remming, de verwerving van verankering-onafhankelijke proliferatie en, uiteindelijk, het vermogen om tumoren te vormen wanneer geïnjecteerd in dieren zijn nuttig meetbare maligne transformatie 3. Verschillende in vitro en in vivo assays zijn ontwikkeld voor cellulaire transformatie. In vitro assays gericht op het identificeren en meten van veranderingen in cultuur morfologie (focusformatie assay), kweek dynamica (groeisnelheid, verzadiging dichtheid) en groeifactor (groei verminderde serum) of ankerplaats (groei in zachte agar) eisen. De gouden standaard voor het bepalen van kwaadaardige karakter van een celtype blijft tumorvorming (xenografts) bij proefdieren. Echter, thij kost en de lengte van in vivo studies ze niet altijd te rechtvaardigen als een eerste validatie stap of de screening van kandidaat oncogenen maken. Hoewel er geen in vitro test geeft een duidelijke beoordeling van de oncogene potentieel van een gen, ze geven inzicht in oncogene potentieel dat kan een beperking van de toekomst in vivo studies. Eén van de meest gebruikte systemen voor de evaluatie oncogeen potentieel in vitro is het Focus Formatie Assay 2. Deze aanpak berust op het gebruik van NIH 3T3 muis fibroblast, een niet-getransformeerde cellijn die sterk contactremming toont. Overexpressie van een oncogen resulteert in het verlies van de dichtheid-afhankelijke groei; getransformeerde cellen kunnen dan in meerdere lagen, vormen "foei", gemakkelijk gevisualiseerd tegen de achtergrond monolaag van niet getransformeerde cellen. De Focus Formation Assay, dan meet het vermogen van een kandidaat oncogen maligne transformatie induceren, zoals blijkt door het verlies van contact inhibvulle als meetbaar fenotype. De FFA is gebruikt voor transformatie evalueren door overexpressie van eiwitkinasen (bv Src 4, BRAF 5), transcriptiefactoren (bijvoorbeeld N-myc 6), G-eiwit gekoppelde receptoren (bv P2RY8 7) en GTPases (bv Ras 1), onder anderen. Het relatieve gemak van deze test maakt het een goede keuze die een snelle en visueel duidelijk antwoord of overexpressie van het gen is voldoende om NIH 3T3 muis fibroblast cellen te transformeren in vitro biedt.
De in dit protocol beschreven FFA gebruikt de Plat-E inpakcellijn 8, die virale verpakking eiwitten levert, en de retrovirale vector pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) aan retrovirus produceren. Na transfectie met pBABEpuro construct dat het gen van belang, de Plat-E cellijn ecotropische retrovirus dat kan worden gebruikt om NIH 3T3 cellen te infecteren. Tzijn virale Werkwijze genafgifte efficiënter is dan traditionele chemische transfectie methoden en biedt een manier om duurzame expressie van het gen 10. Eenmaal opgenomen in het genoom van de NIH 3T3 cellen, wordt overexpressie van het gen van belang aangestuurd door de virale lange eindstandige herhalingen (LTR) promoter 11. Deze constante expressie kan worden vastgesteld of het betreffende gen heeft oncogene activiteit zoals gemeten door de vorming van foci op NIH 3T3 cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De FFA biedt een snelle en eenvoudige methode om maligne transformatie in vitro evalueren. Het is vatbaar voor screening van een relatief groot aantal kandidaat-genen, en zijn bescheiden technische eisen maken het kosten-effectief is. Verder kunnen twee of meer genen co-expressie (soms aangeduid als een "samenwerking" assay) om de tumorigene potentieel van de combinatie te evalueren. De voordelen van deze bepaling afhankelijk zijn eenvoudige techniek, het gemak van kwantificering en de relatief korte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH directeur Nieuwe Innovator Award Program (ED). AA werd mede ondersteund door undergraduate awards van het National Cancer Institute en de National Science Foundation.
Materials
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
Riferimenti
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. . Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5′ and 3′ long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
