Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için
Summary
Odak Oluşumu Testi aday onkogen dönüşürken potansiyelini değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar.
Abstract
Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.
Introduction
Tümör hücrelerinin gen ifadesi örnekleri morfolojik ve proliferatif değişikliklere epigenomics için, değişiklik geniş bir yelpazesi ile, bunların normal emsallerine ayırt edilebilir. Sonuncular içinde, sonuç olarak, hayvanlara enjekte edildiğinde tümör oluşturma yeteneği habis dönüşüm 3 yararlı ölçülebilir göstergeleri, serum bağımlılığı, kontak (yoğunluğu) inhibisyonu kaybı, ankoraj-bağımsız çoğalma satın azalır ve. In vitro ve in vivo tahliller çeşitli hücresel transformasyon için geliştirilmiştir. In vitro deneyler, amaç (düşük serumda büyümesi) belirlenmesi ve kültür morfolojisi (odak oluşumu testi), kültür dinamiği (büyüme oranı, doygunluk yoğunluk) ve büyüme faktörü değişiklikleri ölçülmesi veya gereksinimleri ankraj (yumuşak agar büyüme). Bir hücre tipi malign tabiatını tespit etmek için altın standart deney hayvanlarında tümör formasyonu (ksenogrefleri) kalır. Bununla birlikte, TO mal ve in vivo çalışmalar uzunluğu her zaman aday onkojenlerin ilk doğrulama adımı veya tarama gibi onları haklı yapmazlar. Hiçbir in vitro deney, bir genin onkojenik potansiyeli kesin bir değerlendirmesini sağlar rağmen, onlar in vivo çalışmalar geleceği daraltmak olabilir onkojenik potansiyeli içgörü sağlarlar. In vitro onkojenik potansiyeli değerlendirmek için en yaygın kullanılan sistemlerden biri Odak Oluşumu Testi 2. Bu yaklaşım, NIH 3T3 fare fibroblast, mutlaka temas inhibisyonu gösteren bir dönüştürülmemiş hücre çizgisinin kullanımına dayanır. Yoğunluk bağımlı büyüme kaybına bir onkogen sonuçların aşırı ekspresyonu; Dönüştürülen hücreler daha sonra kolayca dönüştürülmemiş hücrelerin arka plan tek tabaka ile görselleştirildi "odak" oluşturan, çok sayıda tabaka halinde büyüyebilir. İletişim inhib kaybı ile kanıtlandığı gibi odak oluşumu Deneyi, daha sonra, habis dönüşümünün uyarılması için aday onkogen kabiliyetini ölçmektedirölçülebilir fenotip olarak yerleştirme. FFA (örneğin, Src 4 BRAF 5), protein kinazların aşırı ekspresyonu, transkripsiyon faktörleri (örneğin, N-myc 6) (örneğin, P2RY8 7), G-protein bağlı reseptörler ve GTPazlar (örneğin, dönüşümün değerlendirmek için kullanılmıştır Ras 1), ve diğerleri. Bu deneyde göreli kolaylığı genin ekspresyonu in vitro NIH 3T3 fare fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olup olmadığı hızlı ve görsel net bir cevap verecek iyi bir seçim yapar.
Bu protokol açıklanan FFA viral ambalaj proteinleri sağlar Plat-E ambalaj hücre hattı 8, kullanır ve retroviral vektörü pBABEpuro 9 (Addgene plazmid 1764) retrovirüs üretmek. İlgi konusu geni içeren pBABEpuro yapısı ile transfeksiyondan sonra Plat-D hücre çizgisi NIH 3T3 hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir ekotropik retrovirüs üretecektir. TGen teslim onun viral yöntem, geleneksel kimyasal transfeksiyon yöntemlere göre daha etkili olduğunu ve sürdürülebilir geni 10 ifade etmek için bir yol sunar. Bir kez NIH 3T3 hücrelerinin genomu içine dahil edilmiş, ilgi konusu genin aşın virüs uzun terminal tekrarları (LTR) promoteri 11 tarafından tahrik edilir. Bu sabit ifade eden NIH 3T3 hücreleri üzerinde odaklarının oluşumu ile ölçüldüğü haliyle ilgi konusu genin onkojenik etkinliğe sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
FFA in vitro malign transformasyon değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yöntem sağlar. Aday genler nispeten büyük sayıda taranması için uygundur ve mütevazı teknik gereksinimler, maliyet açısından tercih. Bundan başka, iki ya da daha çok gen birlikte eksprese edilebilir kombinasyonunun tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için (bazen "işbirliği" deneyi olarak da adlandırılır). Bu testin avantajları basit tekniği, miktar kolaylığı ve nispeten kısa dönüş etrafı…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH Yönetmenin Yeni Yenilikçi Ödülü Programı (ED) bir hibe ile desteklenmiştir. AA Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı lisans ödülleri kısmen desteklenmiştir.
Materials
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
Riferimenti
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. . Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5′ and 3′ long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
