להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג'ין
Summary
Assay גיבוש הפוקוס מספק שיטה פשוטה להעריך את הפוטנציאל להפוך לאונקוגן מועמד.
Abstract
Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.
Introduction
ניתן להבחין בתאי גידול מעמיתיהם הרגילים על ידי מגוון רחב של שינויים, מדפוסי ביטוי גנים לepigenomics לשינויים מורפולוגיים ושגשוג. בקרב האחרון, הפחית את התלות בסרום, אובדן קשר עיכוב (צפיפות), הרכישה של התפשטות מעגן-עצמאי וסופו של דבר, את היכולת ליצור גידולים כאשר הוזרקו לבעלי חיים הם אינדיקטורים שימושיים, הניתנים למדידה של שינוי הממאיר 3. כמה במבחנה ובמבחני vivo פותחו לשינוי סלולארי. במבחנה מבחני מכוונים לזיהוי ומדידת שינויים במורפולוגיה תרבות (assay היווצרות מוקד), דינמיקת התרבות (שיעור צמיחה, צפיפות רוויה) וגורם גדילה (צמיחה בסרום מופחת) או מעגן (צמיחה באגר רכה) דרישות. תקן הזהב לקביעת האופי הממאיר של סוג תא נשאר היווצרות גידול (xenografts) בחיות מעבדה. עם זאת, לאהוא יעלה ואורך של מחקרי in vivo לא תמיד להפוך אותם מוצדק כצעד ראשון אימות או הקרנה של אונקוגנים מועמד. למרות שאף assay במבחנה מספק הערכה ברורה של הפוטנציאל שבעור של גן, הם מספקים תובנה פוטנציאל שבעור שעשויה לצמצם את העתיד במחקרי vivo. אחת מהמערכות הנפוצות ביותר להערכת פוטנציאל סרטני במבחנה הוא Assay גיבוש הפוקוס 2. גישה זו מסתמכת על השימוש בפיברובלסטים עכבר NIH 3T3, קו תאים לא שינה שמראה עיכוב קשר חזק. ביטוי יתר של תוצאות אונקוגן באובדן צמיחת צפיפות תלויה; תאים הופכים יכולים לגדול אז במספר שכבות, ויצרו "מוקדים", דמיינו בקלות נגד monolayer הרקע של תאים-שינה הלא. גיבוש הפוקוס Assay, אז, מודד את היכולת של אונקוגן מועמד לגרום לשינוי ממאיר, כפי שמעיד על אובדן inhib קשרition כפנוטיפ למדידה. FFA נעשה שימוש כדי להעריך שינוי בביטוי יתר של החלבון קינאז (למשל, 4 Src, BRAF 5), גורמי שעתוק (למשל, N-myc 6) קולטנים, G-מצמידים חלבון (לדוגמא, 7 P2RY8) וGTPases (למשל , ראס 1), בין יתר. הקלות היחסית של assay זה הופכת אותו לבחירה טובה שתספק תשובה מהירה וחזותי ברורה אם ביטוי יתר של הגן די בכך כדי להפוך את תאי פיברובלסטים עכבר NIH 3T3 במבחנה.
FFA המתואר בפרוטוקול זה משתמש בקו Plat-E תא אריזה 8, המספק חלבוני אריזה נגיפיים, וpBABEpuro retroviral הווקטור 9 (פלסמיד Addgene 1764) כדי לייצר רטרו-וירוס. לאחר transfection עם מבנה pBABEpuro המכיל את הגן של עניין, שורת תאי Plat-E תפיק רטרו-וירוס ecotropic שיכול לשמש כדי להדביק תאי NIH 3T3. Tהשיטה הנגיפית של מסירת הגן היא יעילה יותר מאשר שיטות transfection הכימי מסורתיות והיא מציעה דרך לבטא את הגן 10-קיימא. התאגד ברגע שלתוך הגנום של תאי NIH 3T3, ביטוי יתר של הגן של עניין הוא מונע על ידי האמרגן חוזר מסוף ארוך הנגיפי (LTR) 11. ביטוי קבוע זה יכול לשמש כדי לקבוע אם הגן של עניין יש לו פעילות שבעור, כפי שהיא נמדדת על ידי יצירת מוקדים, על תאי NIH 3T3.
Protocol
Representative Results
Discussion
FFA מספק שיטה קלה ומהירה כדי להעריך שינוי ממאיר במבחנה. זה ניתן להקרנה של מספר גדול יחסית של גני מועמדים, והדרישות הטכניות הצנועים שלה לעשות את זה יעיל וחסכוני. יתר על כן, ניתן coexpressed שתיים או יותר גנים (המכונה לעתים assay "שיתוף פעולה") כדי להעריך את הפוטנציאל הסר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מניו Innovator תכנית פרס של מנהל ה- NIH (ED). AA נתמך בחלקו על ידי פרסים לתואר ראשון מהמכון הלאומי לסרטן והקרן הלאומי למדע.
Materials
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
Riferimenti
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. . Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5′ and 3′ long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
