Fokus Formation: En cellbaserad analys för att Bestäm onkogen potential av en gen

Summary

Focus Formation analys ger en enkel metod för att bedöma omvandla potential för en kandidat onkogen.

Abstract

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals¹. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)². When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci¹ that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

Introduction

Tumörceller kan skiljas från deras normala motsvarigheter genom en rad olika förändringar, från mönstren för genuttryck till epigenomik till morfologiska och proliferativa förändringar. Bland de senare, minskat beroende av serum, förlust av kontakt (densitet) inhibition, förvärv av förankringsoberoende spridning och, i slutändan, förmågan att bilda tumörer när de injiceras i djur är användbara, mätbara indikatorer på malign transformation ^3. Flera in vitro och in vivo har utvecklats för cellulär transformation. In vitro-analyser syftar till att identifiera och mäta förändringar i kultur morfologi (fokusbildningsanalys), kulturdynamik (tillväxt, mättnad densitet) och tillväxtfaktor (tillväxt i reducerad serum) eller ankar (tillväxt i mjuk agar) krav. Guldmyntfoten för att fastställa den maligna karaktären av en celltyp förblir tumörbildning (xenotransplantat) hos försöksdjur. Emellertid tHan kostade och längd in vivo-studier inte alltid göra dem motiveras som ett första valideringssteg eller screening av kandidat onkogener. Även om ingen in vitro-analys ger en definitiv bedömning av den onkogena potentialen hos en gen, de ge insikt i onkogen potential som kan begränsa framtida in vivo-studier. En av de mest använda systemen för utvärdering onkogen potential in vitro är Focus Formation analys ^2. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på användning av NIH 3T3-mus-fibroblast, en icke-transformerad cellinje som uppvisar kraftig kontakthämning. Överuttryck av en onkogen resulterar i förlust av densitetsberoende tillväxt; transformerade celler kan sedan växa i flera lager, som bildar "härdar", lätt visualiseras mot bakgrund monolager av icke-transformerade celler. Focus Formation analys, då mäter förmågan hos en kandidat onkogen att inducera malign transformation, vilket framgår av förlusten av kontakt inhibition som en mätbar fenotyp. FFA har använts för att utvärdera transformation genom överuttryck av proteinkinaser (t.ex., Src ^4, BRAF ^5), transkriptionsfaktorer (t.ex., ^N-myc-6), G-proteinkopplade receptorer (t.ex. P2RY8 ⁷⁾ och GTPaser (t.ex. Ras ^1), bland andra. Den relativa lätthet av denna analys gör det till ett bra val som kommer att ge en snabb och visuellt tydligt svar på om överuttryck av genen är tillräcklig för att omvandla NIH 3T3 musfibroblastceller in vitro.

Den FFA beskrivs i detta protokoll använder Plat-E packningscellinje ^8, vilket ger virala förpackningsproteiner, och retrovirusvektorn pBaBepuro ⁹ (Addgene plasmid 1764) att producera retrovirus. Efter transfektion med pBabePuro konstruktion innehållande genen av intresse, kommer Plat-E-cellinjen producerar ekotropiska retrovirus som kan användas för att infektera NIH 3T3-celler. Thans viral metod genavgivning är effektivare än traditionella kemiska transfektionsmetoder och erbjuder ett sätt att på ett hållbart sätt uttrycka genen ^10. När den väl införlivats i genomet av NIH 3T3-celler, är överuttryck av genen av intresse driven av den virala långa terminala upprepningar (LTR) promotom ^11. Denna konstant uttryck kan användas för att bestämma om den intressanta genen har onkogen aktivitet, mätt genom bildandet av foci, på NIH 3T3-celler.

Protocol

1. Göra virala vektorer De kodande sekvenser för genen av intresse, liksom de positiva och negativa kontroller, sätts in pBaBepuro med traditionella kloningsmetoder (PCR-amplifiering, restriktionsspjälkning och ligeringsprodukter). Det finns fyra restriktionsställen på vektorn där DNA kan införas: BamHI, SnaBI, EcoRI och Sall. Förbered transfektion kvalitet plasmid DNA från kompetenta celler med QIAGEN plasmid midi kit. Mät DNA-koncentrationen med användning …

Representative Results

MXD3 är en grundläggande helix-loop-helix leucinzipper (bHLHZ) transkriptionsfaktor som är en medlem av MYC / MAX / MAD nätverk. Det är ett atypiskt medlem av MAD familjen 13-15, och det har rapporterats vara inblandad i carcinogenes 16,17. Vid jämförelse med pBaBepuro (negativ kontroll) och MYC (positiv kontroll), de NIH 3T3 rätter där MXD3 överuttrycktes hade signifikant färre foci (Figur 1A). Data i Figur 1B uppsamlades från flera experiment för att…

Discussion

FFA erbjuder en snabb och enkel metod för att utvärdera malign transformation in vitro. Det är mottaglig för screening av ett relativt stort antal kandidatgener, och dess blygsamma tekniska krav gör det kostnadseffektivt. Vidare kan två eller flera gener samuttrycks (ibland hänvisad till som en "samarbete" -analys) för att utvärdera den tumorogena potentialen hos kombinationen. Fördelarna med denna analys förlita sig på sin enkla teknik, dess enkla kvantifiering och dess relativt korta tur…

Materials

pBABE-puro vector	Addgene	Plasmid 1764	cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	RV-101	cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine	Sigma-Aldrich	93061524	cell line for focus formation assay
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	BD Biosciences	309604	viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter	Whatman	6750-2504	viral production reagent
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent	EMD Millipore	TR-1003-G	cell transfection reagent
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985-062	cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000-044	cell culture media