Abstract
Zell-Zell-Adhäsion ist von grundlegender Bedeutung für Vielzeller und wird durch eine Vielfalt von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Jedoch sind die adhäsiven Wechselwirkungen vieler dieser Proteine schlecht verstanden. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der Hafteigenschaften von mutmaßlichen homophile Zell-Adhäsionsmoleküle. Kultivierten HEK293-Zellen mit Plasmid-DNA, kodierend eine sekretierte, Epitop-tagged Ektodomäne eines Zelloberflächenprotein transfiziert. Unter Verwendung von für die Epitop-Markierung funktionalisierten Kügelchen wird das lösliche, sekretierte Fusionsprotein aus dem Kulturmedium festgehalten. Die beschichteten Perlen können dann direkt in Perlenaggregationstests oder fluoreszierende Perle Sortier Assays für homophile Adhäsion zu prüfen. Falls gewünscht, kann die Mutagenese dann verwendet, um die spezifische Aminosäuren oder Domänen für die Haftung erforderlichen aufzuklären. Dieser Test erfordert nur geringe Mengen an exprimiertem Protein, nicht die Herstellung von stabilen Zelllinien erfordern, und kann acco werdeninnerhalb von 4 Tagen mplished.
Introduction
Zell-Zell-Adhäsion ist wesentlich für die Entwicklung und die Integrität von mehrzelligen Organismen und durch eine Vielfalt von Zelloberflächenmolekülen vermittelt. Viele dieser Adhäsionsmoleküle wurden identifiziert und charakterisiert, obwohl viele noch zu entdecken sind. Verschiedene Methoden werden verwendet, um die Eigenschaften von Zelladhäsionsmolekülen (CAMs), einschließlich Zellsortierung Assays, Zellaggregationsassays 1-8 und biophysikalische Methoden, wie die Rasterkraftmikroskopie und Oberflächenkraftspektroskopie 9-12 untersuchen.
Die Komplexität auch in vitro-Systemen unter Verwendung von Zelllinien vereinfacht macht es schwierig, die Hafteigenschaften eines mutmaßlichen CAM bestimmen. Typischerweise wird ein Molekül als ein CAM, wenn die Zellaggregation induziert, wenn sie in einem nicht-klebenden Zelllinie transfiziert. Es ist jedoch klar, dass dies keine direkte Hinweise auf Haftungsaktivität. Beispielsweise erleichtert die Zelloberfläche Lieferung oder Stabilität einesCAM würde auch zu einer erhöhten Zellaggregation 1,13 führen. Darüber hinaus kann eine wahre CAM nicht, Zellaggregation vermitteln, wenn die Zelllinie fehlt anderen Co-Faktoren für Zelloberflächen Lieferung oder Stabilisierung erforderlich.
Um diese erschwerenden Faktoren zu vermeiden, mehr direkte Assays eingesetzt werden, die auf der Idee basieren, dass adhäsive Wechselwirkungen sollte eine intrinsische biochemische Eigenschaft der extrazellulären Domäne sein. Während Perlen wurden zunächst zur Ng-CAM 2 zu charakterisieren, haben diese Tests, um Cadherin-vermittelte Adhäsion 12,14,15 untersuchen erweitert. Verwendung Fusion des C-Cadherin-Ektodomäne-Fc-Fusionen zeigten die Gumbiner Labor dass mehrere Cadherin Wiederholungen tragen zu Interaktionen 14 homo. Mit vergleichbaren Wulst Aggregationstests, E-Cadherin und N-Cadherin-Haft wurden ebenfalls gekennzeichnet 12,15, als eine Reihe von Protocadherinen 1,15-18 und Dscam Isoformen von Drosophila haben
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Protocol
1. Zellpräparation (Tag -2 bis 0)
- Split HEK293-Zellen 1: 5 unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung und Inkubation in Wachstumsmedium bei 37 ° C mit 5% CO 2, bis 60 bis 80% konfluent (2 - 3 Tage). Für jede Bedingung Kulturzellen in 2 x 100-mm-Schalen.
2. Zell Transfektion (Tag 1)
- Transfektion von HEK293-Zellen mit Plasmid-Codierung Fc-Fusion mit einem Transfektionsreagenz Lipofectamine wie. Alternative Methoden, die in vergleichbaren Transfektionseffizienzen führen, können ebenfalls verwendet werden.
- Rück transfizierten Zellen für 24 Stunden Inkubator.
3. Zellvermehrung (Tag 2)
- Vorheiz Growth Medium ohne fötales Rinderserum (-FBS) bis 37 ° C beträgt.
- Spülen Geschirr 2x mit 10 ml Wachstumsmedien -FBS, und geben die Gerichte an die 37 ° C-Inkubator für 1 Stunde.
- Spülen der Kulturen Geschirr noch einmal mit 10 ml Wachstumsmedien -FBS, für insgesamt 3 Waschungen.
- IncuBeize die transfizierten HEK293-Zellen bei 37 ° C für weitere 48 h ohne FBS vor dem Sammeln Medien.
4. Bead Aggregation (Tag 4)
- Medien von Kulturschalen sammeln, übertragen Sie Medien von jedem Paar von Gerichten zu 50 ml konischen Röhrchen und Spin bei 500 g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren.
- Filtermedien 50 ml konischen Röhrchen in ein Zentrifugalfilter mit einer 30 ml Spritze und 0,45 um-Spritzenfilter.
- Spin Zentrifugalfilter bei 4.000 × g und 4 ° C bis zum Volumen der konzentrierten Kulturmedium beträgt etwa 500 ul (etwa 15 min). Wiederholen, bis alle Kulturmedien wurde hinzugefügt und eingeengt.
- Fügen 1,5 ul Protein G magnetischen Kügelchen auf 1 ml eiskaltem Bindungspuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe, auf ein Magnet und entfernen Puffer. Sofort die geballte Kulturmedien, um das Protein G magnetischen Beads hinzuzufügen.
- Drehen Röhrchen bei 4 ° C für 2 Stunden.
- PlAss Rohre auf einem Magneten und Medien zu entfernen. Waschen schnell Perlen zweimal mit eiskaltem 1 ml Binding Buffer, und dann wieder zu suspendieren Perlen in 300 ul Binding Buffer.
- Split resuspendiert Perlen in 2 Röhren, 150 ul in jedes Rohr, und fügen Sie 1,5 ul 200 mM CaCl 2 oder 200 mM EDTA für die "Calcium" und "kein Kalzium" Bedingungen auf.
- Transfer 100 ul von jedem Zustand in einen Depression gut schieben und sammeln mikroskopischen Aufnahmen mit einem Durchlichtmikroskop (Abbildung 2). Sammeln Sie Bilder von 5 Sichtfelder für jedes Experiment an jedem gewünschten Zeitpunkt.
5. Datenanalyse
- Mit ImageJ oder vergleichbare Bildanalyse-Software, öffnen Sie eine der fünf Bilddatensätze mit dem Import / Bildsequenz ... aus dem Pulldown-Menü Datei. Diese werden als Bildstapels geöffnet werden.
- Im Dialogfeld Bild ... / Eigenschaften, ändern Sie die iMagier Einheiten auf Pixel und setzen Pixel Breite und Höhe bis 1,0 Pixel.
- Konvertieren Sie die Bilder in dual mit dem Anpassen / Schwellenwert ...-Befehl in der Bild Pulldown-Menü. Stellen Sie den Schwellenwert auf Pixel, die Perlen oder Perlen Aggregate beitragen, umfassen, aber das auszuschließen Hintergrund und kleinen Partikeln. Gelten für alle Bilder im Stapel.
- Im Dialogfeld Set Maße, überprüfen Sie die Umgebung und Stack Position Boxen.
- Analyze Particles ... in der Analyse Pulldown-Menü. Dadurch wird eine Liste der identifizierten Partikel, einschließlich ihrer Größe (Fläche) und das Bild in der sie erkannt zu generieren.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Experimente und Versuchsbedingung.
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Representative Results
Ein Beispiel ist in Abbildung 2, die Kalzium-abhängige Aggregation zeigt Wulst von der Ektodomäne von N-Cadherin-Fc (NcadEC-Fc) fusioniert dargestellt. In Abwesenheit von Calcium, Perlen weisen eine geringe oder keine Tendenz zu aggregieren, und es gibt keine Zunahme der Gesamtgröße mit der Zeit (1A, C). In Anwesenheit von Calcium, Perlen mit NcadEC-Fc-Show robust Aggregation beschichtet, mit Aggregatgröße über die Zeit (Abbildung 1B, C) zu. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt, wobei jeweils bestehend aus Bilder von fünf nicht-überlappenden Bereichen. Die Teilchengröße in Pixelbereich für jedes Aggregat in den fünf Bereichen bestimmt. Diese Daten wurden für jeden Zeitpunkt, in jedem Versuch gemittelt. Die Daten aus den drei Experimenten wurden gemittelt, um Mittelwerte und Standardfehler der Messung zu jedem Zeitpunkt (2C) zu bestimmen.
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Abbildung 1. Die Verwendung von sezerniert, epitopmarkierter Ektodomänen in Perlenaggregationstests. (A) Schematische Darstellung der Organisation eines typischen Single-Pass Trans Zelladhäsionsmolekül (oben), die eine Signalsequenz (S), eine Ektodomäne hat, eine Transmembrandomäne (T) und eine intrazelluläre Domäne (ICD). Um eine sekretierte Form des Ektodomäne, einem Segment, das die Transmembran-und intrazellulären Domänen an Fc-Region von menschlichem IgG (unten). (B), wenn in kultivierte Zellen transfiziert fusioniert fehlt erzeugen, wird die ectomain-Fc-Fusion exprimiert und sezerniert wird, in Das Kulturmedium, in dem sie eingefangen und auf Protein A oder Protein G Magnetkügelchen gereinigt werden. Protein A oder Protein G als schwarze Kreise auf den Perlen Nach dem Waschen dargestellt. (C) werden die Ektodomäne-Fc-beschichteten magnetischen Kügelchen erlaubt, zu aggregieren, als Test für die homophile adhäsive Wechselwirkungen.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Bead Aggregationstest. (A) Die klassischen Cadherine, wie N-Cadherin und E-Cadherin, vermitteln Calcium-abhängigen, homophile Adhäsion. In Abwesenheit von Calcium (ohne Zusatz von Calcium und 2 mM EDTA), Cadherine nicht, adhäsive Wechselwirkungen vermitteln. Dargestellt ist ein Bild von Protein G mit der Ektodomäne von Zebrafisch N-Cadherin-Fc (NcadEC-Fc) fusioniert beschichteten magnetischen Kügelchen. (B) NcadEC-Fc-beschichteten Kügelchen wurden für 1 Stunde in Gegenwart von 2 mM CaCl aggregieren 2. Homophile Adhäsion durch die N-Cadherin-Ektodomäne aus der Bildung von großen Aggregaten Wulst sichtbar. (C) als eine semi-quantitative Messung der Haftung, kann die Größe der Aggregate gemessen werden. Eine Methode, dies zu erreichen, ist die Gegend mit dem besetzten messenunterschiedliche Aggregate im Durchlicht-Bilder. Die mittlere Größe der Aggregatfläche kann als eine Funktion der Zeit aufgezeichnet werden, wie hier gezeigt, oder das Verhältnis der mittleren Aggregatfläche in der Gegenwart oder Abwesenheit von Calcium berechnet werden. Die Aggregation der NcadEC-Fc-beschichteten Kügelchen in Anwesenheit von Calcium (geschlossene Kreise) und in Abwesenheit von Calcium (offene Kreise) wurde bei 15 min Abständen über den Verlauf von 1 h bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
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Discussion
Zelladhäsion ist ein wesentliches Merkmal der vielzelligen Leben und wird von einem breiten Spektrum von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Von diesen sind die detaillierten Klebeeigenschaften nur für einen relativ kleinen Anteil verstanden. Hier haben wir ein einfaches, schnelles Protokoll zur Untersuchung der homophile Haftfähigkeit von sekretierten Ektodomänen in einem geeigneten Epitop-Tag fusioniert beschrieben. Dieser Ansatz hat eine Reihe von wichtigen Vorteilen. Zuerst werden die stabilen Zelllinien nicht erforderlich, 14,20, wie ausreichende Mengen an Protein durch transiente Transfektion von 100-mm-Schalen erzeugt werden. Dies ermöglicht das Screening von größeren Zahlen von Konstrukten - zB Punkt oder Deletionsmutanten - ohne den Aufwand und die Kosten der Erzeugung und Aufrechterhaltung einer großen Anzahl von Zelllinien. Zweitens, diese Wulst Assays sind direkte Untersuchungen der biochemischen Eigenschaften der putativen Adhäsionsmolekülen in einem reduzierten System. Daher kann die Adhäsion direkt an das Protein zurückzuführenuntersucht, sondern als potentielle indirekte Effekte. Drittens, die Auswirkungen möglicher Co-Faktoren zu untersuchen, Zellen mit sekretierte Formen des mutmaßlichen Adhäsionsmolekül und seine mutmaßliche Cofaktor, die jeweils mit einem unterschiedlichen Epitop-Tag cotransfiziert werden. Darüber hinaus ist dieser Ansatz flexibel, wie es für die Verwendung mit einer Vielfalt von geeigneten Epitop-Tags angepasst werden. So sind beispielsweise gleich großen Magnetkugeln zur Verfügung, die an Protein A oder G (Fc-Tag) konjugiert sind, Streptavidin (Strep II-Tag), Glutathion (GST-Tag) oder Talon oder Ni: NTA (6x His-Tag). Schließlich ist die Verfügbarkeit von fluoreszierenden Kügelchen können das gleiche Protokoll angepasst für einfaches Sortieren Assays homophile Spezifität zu untersuchen. In diesem Szenario, rot und grün fluoreszierenden Kügelchen, die jeweils mit einer verschiedenen CAM beschichtet sind, vermischt und der Grad der Durchmischung und Trennung bewertet.
Trotz dieser Vorteile sind auch Einschränkungen. Erste, Proteinfragmente auf Perlen in Lösung nichtrekapitulieren die Komplexität der in vivo Situation. Einzelzellen exprimieren spezifische Komplemente von Zelloberflächenproteinen und deren intrazelluläre Effektoren. Jede von diesen kann entweder direkt oder indirekt auf die Haftung haben, und viele dieser Effekte nicht in Perlenassays reflektiert. Zum Beispiel kann ein Molekül, das stark, heterophile Adhäsion vermitteln (es ist ein CAM), würde aber Wulst Aggregation in diesen Tests nicht induzieren. Zweitens sind Wulst Assays nur semi-quantitativ und nicht zuverlässige, quantitative Informationen über die relative Stärke der adhäsiven Wechselwirkungen. Schließlich alle Moleküle, die wir untersucht haben, sind Typ I, Single-Pass-Membranproteine, bei denen der Klebstoff Domäne auf einem einzigen zusammenhängenden Polypeptids vorliegt. Es ist wahrscheinlich, dass viele CAMs können Multi-Pass-Transmembranproteine, die eine Haftmittelzwischenfläche aus mehreren Ektodomäne Regionen aufgebaut haben. Dieser Test würde nicht leicht an solche Moleküle sein.
For Wulst Assays zuverlässig zu sein, müssen die Bedingungen reproduzierbar sein. Es gibt zwei mögliche Quellen von Variabilität in diesen Assays. Die erste ist die Variabilität in der Proteinspiegel. Wenn es Schwankungen der Expressionsniveaus durch Variation der Transfektionseffizienz oder schlecht exprimierten Proteins können die Kügelchen nicht gesättigt, und die Ergebnisse unzuverlässig sein. Stand der Wulst Aggregation Implementierungen verwenden eine definierte Menge an gereinigtem Ektodomäne Fusionsprotein. Typischerweise wird dieses Fusionsprotein in großen Chargen von stabilen Zellinien gereinigt und in mehreren Experimenten verwendet werden. Da die Menge der Kügelchen in jedem Experiment verwendet, und die Menge des Proteins erforderlich ist, sehr klein ist, kann eine vergleichbare Reproduzierbarkeit mit transienter Transfektion erreicht werden. Die magnetischen Kügelchen, die wir benutzen, haben eine Bindungskapazität von ~ 250 ng / L des resuspendierten Perlen. Eine typische Transfektion von 2 × 100 mm-Schalen ergibt sich eine große Überschuß an Protein, die mit einem sekundären Bindungsschritt überprüft werden kann, unter Verwendung des SuperNatant nach der anfänglichen Bindung des Fusionsproteins an die Kügelchen. Die zweite mögliche Quelle von Variabilität ist die Menge der Kügelchen verwendet. Die magnetischen Kügelchen, die wir benutzen, sind als 30 mg / ml Schlamm, der schnell erledigt geliefert. Reproduzierbarkeit, müssen die Perlen vollständig suspendiert werden und die entsprechende Lautstärke schnell extrahiert, bevor die Kugeln beginnen zu begleichen. Eine Alternative ist es, vor der verdünnten eine definierte Menge der Kügelchen in einem größeren Volumen. Diese vorverdünnt Perlen können in einem größeren Volumen (15 l statt 1,5 l) zugesetzt werden, um Fehler zu vermeiden Pipettieren. Wenn die richtige Pflege nicht genommen wird, wird es Experiment zu Experiment Variabilität in der Menge von Perlen verwendet wird. Dies könnte die Aggregationsgeschwindigkeit beeinflussen, was zu Unterschieden in der Gesamtgröße zu einem bestimmten Zeitpunkt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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