Abstract
Adesione cellula-cellula è fondamentale per la vita pluricellulare ed è mediata da una gamma diversificata di proteine di superficie cellulare. Tuttavia, le interazioni adesive per molte di queste proteine sono poco conosciuti. Qui vi presentiamo un metodo rapido semplice per caratterizzare le proprietà adesive delle molecole di adesione cellulare omofiliche putativi. HEK293 cellule coltivate vengono trasfettate con il plasmide di DNA che codifica un secreto, epitopo-tagged ectodomain di una proteina di superficie cellulare. Utilizzando perline funzionalizzati specifici per il tag epitopo, il, proteina di fusione solubile secreta viene catturato dal mezzo di coltura. Le perle rivestite possono essere utilizzati direttamente nel tallone metodiche di aggregazione o in cordone fluorescente smistamento test per verificare l'adesione homophilic. Se lo si desidera, mutagenesi può quindi essere utilizzato per chiarire gli amminoacidi specifici o domini richiesti per l'adesione. Questo test richiede solo piccole quantità di proteina espressa, non richiede la produzione di linee cellulari stabili, e può essere ACCOmplished in 4 giorni.
Introduction
Adesione cellula-cellula è essenziale per lo sviluppo e l'integrità degli organismi multicellulari ed è mediata da una gamma diversificata di molecole di superficie cellulare. Molte di queste molecole di adesione sono stati identificati e caratterizzati, anche se molti rimangono da scoprire. Diversi metodi sono utilizzati per studiare le proprietà delle molecole di adesione cellulare (CAM), tra cui separazione delle cellule saggi, saggi di aggregazione delle cellule 1-8 e metodi biofisici, come la microscopia a forza atomica e spettroscopia di forza di superficie 9-12.
La complessità di anche semplificata nei sistemi in vitro su linee cellulari rende difficile determinare le proprietà adesive di una CAM putativo. Tipicamente, una molecola è considerata una CAM se induce aggregazione cellulare quando trasfettati in una linea cellulare non adesivo. Tuttavia, è chiaro che questa non è una prova diretta dell'attività adesivo. Per esempio, facilitando la consegna superficie cellulare o la stabilità di unCAM potrebbe anche tradursi in una maggiore aggregazione delle cellule 1,13. Inoltre, un vero CAM potrebbe non riuscire a mediare aggregazione cella se la linea cellulare manca di altri co-fattori necessari per la consegna superficie cellulare o stabilizzazione.
Per evitare questi fattori di complicazione, le analisi più dirette possono essere impiegate che si basano sull'idea che le interazioni adesive dovrebbe essere una proprietà biochimica intrinseca del dominio extracellulare. Mentre perline sono stati inizialmente utilizzati per caratterizzare Ng-CAM 2, questi test sono stati estesi al fine di indagare caderina-mediata adesione 12,14,15. Utilizzando fusione dei C-caderina ectodomain-Fc fusioni, il laboratorio Gumbiner ha mostrato che più ripetizioni caderina contribuiscono a omofiliche interazioni 14. Utilizzando comparabili metodiche di aggregazione tallone, E-caderina e N-caderina adesione sono stati anche caratterizzati 12,15, come avere un numero di protocadherins 1,15-18 e isoforme Dscam di Drosophila
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Protocol
1 Cella di preparazione (Giorno -2 a 0)
- Split cellule HEK293 1: 5 con 0,05% di soluzione di tripsina-EDTA e incubare in crescita media a 37 ° C con il 5% di CO 2 fino al 60 - 80% confluenti (2 - 3 giorni). Per ogni condizione, le cellule di coltura in 2 x 100 piatti mm.
2. cellulare trasfezione (giorno 1)
- Trasfezione le cellule HEK293 con plasmide codificante Fc-fusion che usano un reagente di trasfezione quali Lipofectamine. Metodi alternativi che si traducono in efficienza di transfezione comparabili possono anche essere utilizzati.
- Ritorna cellule trasfettate per incubatore per 24 ore.
3. cellulare Propagazione (Day 2)
- Preriscaldare mezzi di crescita senza siero fetale bovino (-FBS) a 37 ° C.
- Sciacquare piatti 2x 10 ml Crescita media -FBS, e restituiscono i piatti per la 37 ° C incubatore per 1 ora.
- Sciacquare la culture piatti ancora una volta con 10 ml Crescita media -FBS, per un totale di 3 lavaggi.
- Incubate le cellule HEK293 trasfettate a 37 ° C per altre 48 ore senza FBS prima di raccogliere i media.
4. Perlina Aggregation (Giorno 4)
- Per raccogliere i supporti dalle piastre di coltura, trasferire file multimediali da ogni coppia di piatti da 50 ml provette coniche e spin a 500 xg per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari.
- Filtranti da 50 ml tubo conico in un filtro centrifugo con una siringa da 30 ml e 0,45 micron filtro a siringa.
- Spin filtri centrifughi a 4.000 xg e 4 ° C fino al volume di terreno di coltura concentrato è di circa 500 microlitri (circa 15 minuti). Ripetere fino a quando è stato aggiunto tutti i media cultura e concentrato.
- Aggiungere 1,5 ml di proteina G sfere magnetiche a 1 ml di freddo ghiaccio Binding Buffer in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni campione, posto su un magnete e rimuovere il tampone. Aggiungere immediatamente il terreno di coltura concentrato alla proteina G sfere magnetiche.
- Ruotare i tubi a 4 ° C per 2 ore.
- Pltubi asso su un magnete e rimuovere i supporti. Lavare rapidamente perle due volte con il freddo ghiaccio 1 ml di Binding Buffer, e poi risospendere perline in 300 microlitri Binding Buffer.
- Split perline risospeso in 2 tubi, 150 ml in ciascun tubo, e quindi aggiungere 1,5 ml di mM CaCl 2 o 200 mM EDTA 200 per il "calcio" e condizioni "non calcio", rispettivamente.
- Trasferire 100 microlitri di ciascuna condizione di una depressione ben scorrere raccogli micrografie utilizzando un microscopio a luce trasmessa (Figura 2). Raccogliere immagini da 5 campi di visualizzazione per ogni esperimento in ogni punto desiderato.
Analisi dei dati 5.
- Utilizzando ImageJ, o software di analisi dell'immagine paragonabile, aprire uno dei cinque set di dati di immagine utilizzando l'Importazione / Sequenza d'immagini ... dal menu a tendina File. Questi saranno aperti come una serie di immagini.
- Nella finestra di dialogo ... Immagine / Proprietà modificare l'iunità mage per pixel e impostare Pixel Larghezza e Altezza pixel a 1.0.
- Convertire le immagini in binario usando il / Soglia Regola ... comando nel menu a tendina immagine. Impostare la soglia per includere i pixel che contribuiscono a perline o aggregati tallone, ma che escludono background e piccole particelle. Applica a tutte le immagini nello stack.
- Nella finestra di dialogo Imposta misurazioni, selezionare le caselle di area e Stack di posizione.
- Eseguire Analizza particelle ... nel Analizza menu a tendina. Questo genererà un elenco di particelle identificate, compresa la loro dimensione (area) e l'immagine in cui sono stati identificati.
- Ripetere questo processo per il quale sperimentare e condizione sperimentale.
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Representative Results
Un esperimento di esempio è presentato in figura 2, che mostra tallone aggregazione calcio-dipendente dal ectodomain di N-caderina fuso a Fc (NcadEC-Fc). In assenza di calcio, perline mostrano poca o nessuna tendenza ad aggregarsi e non vi è alcun aumento delle dimensioni aggregata con il tempo (Figura 1A, C). In presenza di calcio, perline rivestite con NcadEC-Fc mostra robusta aggregazione, con granulometria crescente nel tempo (Figura 1B, C). Questo esperimento è stato ripetuto tre volte, con ogni istanza comprensivi di immagini da cinque campi non sovrapposti. La dimensione delle particelle in un'area di pixel è stato determinato per ciascun aggregato nei cinque campi. Questi dati sono stati mediati per ciascun time-point in ogni esperimento. I dati provenienti dai tre esperimenti sono stati mediati per determinare i mezzi e gli errori standard di misura in ogni punto temporale (Figura 2C).
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Figura 1 Utilizzo dei secreti, ectodomains epitopi-tagged in metodiche di aggregazione tallone. (A) Schema che mostra l'organizzazione di un tipico, a passaggio singolo cell adhesion molecule transmembrana (in alto), che ha una sequenza di segnale (S), un ectodomain, un dominio transmembrana (T) e un dominio intracellulare (ICD). Per generare una forma secreta del ectodomain, un segmento che non ha i domini transmembrana e intracellulari viene fuso alla regione Fc delle IgG umane (in basso). (B) Quando trasfettati in cellule in coltura, la fusione ectomain-Fc è espressa e secreta nel il terreno di coltura, dove può essere catturato e purificato su proteina G sfere magnetiche proteina A o. Proteina A o proteina G sono mostrati come cerchi neri sulle perle. (C) Dopo il lavaggio, le sfere magnetiche ectodomain-Fc rivestiti possono aggregare, come una prova di interazioni adesive omofiliche.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Bead test di aggregazione. (A) Le caderine classiche, come la N-caderina e di E-caderina, mediano calcio-dipendente, l'adesione homophilic. In assenza di calcio (senza calcio e 2 mM EDTA aggiunto), caderine riescono a mediare interazioni adesive. Indicato qui è l'immagine di proteine G biglie magnetiche rivestite con la ectodomain di zebrafish N-caderina fuso a Fc (NcadEC-Fc). (B) perle rivestite NcadEC-Fc è stato permesso di aggregare per 1 ora in presenza di 2 mM CaCl 2. Adesione omofiliche dai ectodomains N-caderina risulta dalla formazione di grandi aggregati tallone. (C) Come misura semi-quantitativa di adesione, la dimensione degli aggregati può essere misurata. Un metodo per ottenere questo risultato è quello di misurare l'area occupata dalaggregati distinti nelle immagini luce trasmessa. La dimensione media della zona globale può essere rappresentata come una funzione del tempo, come mostrato qui, o il rapporto tra cumulato medio in presenza o assenza di calcio può essere calcolato. L'aggregazione di perline rivestite NcadEC-Fc in presenza di calcio (cerchi chiusi) e in assenza di calcio (cerchi aperti) è stato determinato a 15 min intervalli nel corso di 1 ora. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questo figura.
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Discussion
L'adesione cellulare è una caratteristica essenziale della vita pluricellulare ed è mediata da una vasta gamma di proteine di superficie cellulare. Di questi, le proprietà adesive dettagliate sono compresi solo una parte relativamente piccola. Qui, abbiamo descritto un protocollo rapido semplice per indagare la capacità adesiva homophilic di ectodomains secreti fuse a un tag epitopo conveniente. Questo approccio ha una serie di importanti vantaggi. In primo luogo, le linee cellulari stabili non sono necessari 14,20, come quantità sufficienti di proteina possono essere generati mediante trasfezione transiente pari a 100 mm piatti. Questo permette la proiezione di un maggior numero di costrutti - per esempio, punto o cancellazione mutanti - senza sforzo e spesa di generare e mantenere un gran numero di linee cellulari. In secondo luogo, questi test perline sono prove dirette delle proprietà biochimiche delle molecole di adesione putativi in un sistema ridotto. Pertanto, l'adesione può essere direttamente attribuita alla proteinasotto inchiesta, piuttosto che i potenziali effetti indiretti. In terzo luogo, per studiare gli effetti di possibili co-fattori, le cellule possono essere co-trasfettate con forme secrete della molecola di adesione putativo e il suo putativo co-fattore, ciascuno con un epitopo distinto. Inoltre, questo approccio è flessibile, in quanto può essere adattato per l'uso con una varietà di appropriati tag epitopo. Ad esempio, sfere magnetiche uniformemente dimensioni sono disponibili che sono coniugati alla proteina A o G (tag Fc), streptavidina (Strep tag II), glutatione (tag GST), o TALON o Ni: NTA (6x sua etichetta). Infine, la disponibilità di perline fluorescenti permette lo stesso protocollo per essere adattato per semplici test di smistamento per indagare la specificità homophilic. In questo scenario, perline fluorescenti rossi e verdi, ognuna rivestita con un CAM distinto, sono mescolati e il grado di mescolamento o di segregazione viene valutata.
Nonostante questi vantaggi, ci sono anche avvertimenti. In primo luogo, frammenti proteici di perline in soluzione non lo fannoricapitolare la complessità della situazione in vivo. Le singole celle esprimono complementi specifici di proteine di superficie delle cellule e dei loro effettori intracellulari. Ognuno di questi può avere effetti diretti o indiretti sulla adesione, e molti di questi effetti non saranno riflesse nei test tallone. Per esempio, una molecola può mediare forte adesione eterofilo (è un CAM), ma non indurrebbe aggregazione tallone in questi saggi. In secondo luogo, saggi perline sono solo semi-quantitativa e non forniscono informazioni affidabili e quantitative sulla forza relativa delle interazioni adesive. Infine, tutte le molecole che abbiamo indagato sono di tipo I, single-pass proteine di membrana in cui è presente su un singolo, polipeptide contiguo il dominio adesivo. E 'probabile che molti CAM potrebbe essere multi-pass proteine transmembrana che dispongono di un'interfaccia adesiva costruita da più regioni ectodomain. Questo test non sarebbe facilmente adattabile a tali molecole.
Fosaggi r tallone di essere affidabili, le condizioni devono essere riproducibile. Ci sono due potenziali fonti di variabilità in questi test. Il primo è la variabilità nei livelli di proteine. Se vi è variabilità nei livelli di espressione, a causa delle variazioni di efficienza di trasfezione o una proteina mal espressa, le perline non possono essere saturi ed i risultati possono essere inaffidabili. Precedenti implementazioni di aggregazione tallone utilizzano una quantità definita di proteina purificata ectodomain-fusion. Tipicamente, questa proteina di fusione viene purificato in grandi lotti di linee cellulari stabili e può essere utilizzato in diversi esperimenti. Poiché la quantità di sfere utilizzate in ogni esperimento e la quantità di proteine necessaria è molto piccola, una riproducibilità analogo può essere ottenuto con trasfezione transiente. Le sfere magnetiche che usiamo hanno una capacità di legame di ~ 250 ng / L di microsfere in sospensione. Una trasfezione tipica di 2 x 100 mm stoviglie risultati in un vasto eccesso di proteina, che può essere verificata con una fase legante secondario, utilizzando il supernatant dopo l'iniziale legame della proteina di fusione ai talloni. Il secondo potenziale fonte di variabilità è la quantità di sfere utilizzate. Le sfere magnetiche che utilizziamo sono forniti come 30 mg / ml di liquame che si deposita rapidamente. Per riproducibilità, le perle devono essere risospese completamente e il volume relativo estratto in fretta, prima che le perle iniziano a stabilirsi. Una alternativa è quella di pre-diluire un numero definito di perle in un volume maggiore. Questi granuli pre-diluiti possono essere aggiunti in un volume più grande (15 L anziché 1,5 L) per evitare errori di pipettaggio. Se la cura adeguata non è presa, ci saranno esperimento a esperimento variabilità nella quantità di sfere utilizzate. Questo potrebbe influenzare il tasso di aggregazione, che porta a differenze nella dimensione aggregata in un periodo di tempo specificato.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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