3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
والهدف من هذا البروتوكول هو الفيديو لمناقشة كيفية تنفيذ وتحليل الفلورسنت المدارية التجربة تتبع الجسيمات ثلاثية الأبعاد باستخدام تعديل ثنائي الفوتون المجهر 1. على العكس من الأساليب التقليدية (مسح النقطية أو حقل واسع بناء على كومة من الإطارات)، تتبع المداري 3D يسمح لحصر ومتابعة مع مكانية عالية (10 دقة نانومتر) والقرار الزماني (استجابة التردد 50 هرتز) من تشريد 3D الجسيمات الفلورية تتحرك على طول جداول من مئات ميكرون 2. وتستند هذه الطريقة على خوارزمية ردود الفعل التي تسيطر على الأجهزة من ثنائي الفوتون مجهر المسح بالليزر من أجل أداء مدار دائري حول الكائن لتعقبها: فإن آلية التغذية المرتدة حفاظ على الكائن الفلورسنت في المركز عن طريق التحكم في تشريد مسح شعاع 3-5. للتدليل على مزايا هذه التقنية، تابعنا على عضية تتحرك بسرعة، ويحلول، داخل حركةتعيشان خلية 6،7. كانت مطلية خلايا وفقا لبروتوكولات القياسية، وملطخة باستخدام تجاريا يحلول صباغة. نناقش بإيجاز تكوين الأجهزة وبمزيد من التفصيل برنامج حاسوبي لمراقبة، لإجراء تجربة تتبع المدارية 3D داخل الخلايا الحية. نناقش بالتفصيل المعلمات المطلوبة من أجل السيطرة على مجهر المسح وتمكين الحركة من الحزم في مدار مغلق حول الجسيمات. نستنتج من خلال إظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدامها بشكل فعال لتتبع حركة سريعة من يحلول صفت على طول الأنابيب الدقيقة في 3D داخل الخلية الحية. يمكن أن الجسيمات الحالة تتحرك بسرعات تتراوح بين 0.4-0.5 ميكرون / ثانية، وعرض عادة حركة موجهة على طول شبكة أنيبيب 8.
Introduction
وقد تم تطوير عدد كبير من النهج حتى الآن لتعقب جزيئات الفلورسنت في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر. معظم المناهج تعتمد على استخدام كاميرات سريعة، مناسبة بشكل مثالي لتتبع في بعدين، جنبا إلى جنب مع التعديلات عادة مخصصة للبصريات انبعاث المجهر لتحقيق تتبع في الاتجاه المحوري. المجاهر المسح بالليزر (إما مبائر أو اثنين من الفوتونات) تقليديا يمكن تتبع الجسيمات الفلورية عن طريق إجراء تسلسل وقت ض مداخن، على الرغم من أن هذه العملية هي عادة وقتا طويلا، وغلة قرار زمنية معقولة (10 هرتز) فقط إذا كانت الجسيمات يجري تعقب هو أبقى في وسط منطقة التصوير النقطية الصغيرة من خلال آلية ردود فعل نشطة 2.
فكرة تأمين في أن الجسيمات هي قاعدة تتبع طريقة المداري. بدلا من خطوط المسح مسح يتم تنفيذ مدار دائري حول الجسيمات الفلورية. كثافة مضان على طولالمدار يموضع بالضبط موقف الجسيمات 4.
ويمكن بعد ذلك الموقف مترجم من الجسيمات أن تستخدم لتحفيز الماسحات الضوئية المجهر وإعادة مركز المدار على موقف الجسيمات. هي التي تحرك الماسحات الضوئية الجلفانومتر المجهر من قبل الجهد التناظرية. المكون AC هذا الجهد تتيح أداء مدار مع تركيز شعاع الليزر، أي الجيب وجيب التمام موجة تطبيقها على X و Y مسح المرايا سيسمح أداء مدار دائري. العاصمة إزاحة إشارة يسهل تغيير موقف مركز المدار. مرة واحدة يتم تحديد فترة المدار ويتم تكوين الموجي للإشارة AC، يحتاج نظام التغذية المرتدة لتحديث فقط المكون DC للإشارة.
مطلوب وهناك برامج قادرة على قراءة إشارة الفلورسنت التي تم جمعها من كشف للسيطرة على الماسحات الضوئية وأجهزة الكشف، لحساب الموقف من الجسيمات وتحديث DC خارجتعيين. عن ردود الفعل الناجح التصوير اختيار دقيق للمعلمات المدار (حجم وتوقيت) مطلوب وهذه المعايير يجب أن يتم تعديلها بناء على خصائص الجسيمات الفلورية أنه من الضروري أن تتبع.
وقد وصفت الأسس الفيزيائية والرياضية لهذه التقنية في الماضي 4،5 لكل من 2D و 3D التطبيقات. في هذا البروتوكول وصفنا لفترة وجيزة مكونات الأجهزة الرئيسية للالإعداد، وبمزيد من التفصيل اختيار المعلمات وإعداد العينات اللازمة لتجربة نموذجية السماح لنا بعد النزوح من يحلول في القرار الزماني عالية داخل الخلية الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من تقدمات هائلة من تقنيات مضان المجهري وأدوات القياس على مدى السنوات الماضية، تحقيق مسارات الجسيمات الفلورية في ثلاثة أبعاد مع قرار زمنية عالية ظلت تحديا في هذا المجال. إذا تم تحقيق ارتفاع القرار الزماني الجسيمات تتبع في بعدين، والإرشاد إلى الاتجاه المحور…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
Riferimenti
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
