3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
Das Ziel dieses Video-Protokoll ist zu diskutieren, wie mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop 1 durchzuführen und zu analysieren, eine dreidimensionale Fluoreszenzorbitalpartikelverfolgung Experiment. Wie zu herkömmlichen Ansätzen (Rasterabtastung oder Weitfeld basierend auf einem Stapel von Frames) gegenüberliegt, kann die 3D-Tracking-Orbital zu lokalisieren und zu verfolgen mit hoher räumlicher (10 nm Genauigkeit) und zeitliche Auflösung (50 Hz Frequenzgang) die 3D-Verschiebung ein bewegtes fluoreszierende Partikel auf Längenskalen von Hunderten von Mikrometern 2. Das Verfahren basiert auf einem Algorithmus, der die Rückkopplungs Hardware eines Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um eine Kreisbahn um das Objekt auszuführen steuert basierend verfolgt werden: Der Rückkopplungsmechanismus wird das fluoreszierende Objekt in der Mitte durch die Steuerung der Verschiebung zu halten der Abtaststrahl 3-5. Um die Vorteile dieser Technik zu demonstrieren, folgten wir einem sich schnell bewegenden Organelle, das Lysosom, in aliving Zelle 6,7. Zellen wurden nach Standardprotokollen überzogen, und unter Verwendung eines im Handel Lysosom Farbstoff. Wir besprechen kurz die Hardware-Konfiguration und im Detail die Steuer-Software, um eine 3D-Orbital Tracking-Experiment in lebenden Zellen durchzuführen. Diskutieren wir im Detail die um die Rastermikroskop zu steuern und zu ermöglichen, die Bewegung des Strahls in einer geschlossenen Bahn um die Teilchen erforderlichen Parameter. Wir schließen, durch den Nachweis, wie diese Methode effektiv verwendet, um die schnelle Bewegung eines markierten Lysosom an Mikrotubuli in 3D in einer lebenden Zelle zu verfolgen. Lysosomen mit Geschwindigkeiten im Bereich von 0,4-0,5 um / s bewegen, in der Regel Anzeige einer gerichteten Bewegung entlang der Mikrotubuli-Netzwerk 8.
Introduction
Zahlreiche Ansätze sind bisher entwickelt worden, um fluoreszierende Partikel in drei Dimensionen unter Verwendung eines Mikroskops zu verfolgen. Die meisten Ansätze beruhen auf der Verwendung von schnellen Kameras ideal geeignet, um in zwei Dimensionen, die typischerweise mit individuellen Änderungen der Emissionsoptik des Mikroskops kombiniert Verfolgung in axialer Richtung zu erreichen verfolgen. Laser-Scanning-Mikroskop (entweder konfokale oder zwei Photonen) üblicherweise eine Leuchtstoffpartikel durch Ausführen einer zeitlichen Abfolge von Z-Stapeln zu verfolgen, wobei dieses Verfahren typischerweise zeitaufwendig und liefert angemessene zeitliche Auflösung (10 Hz), wenn das Teilchen verfolgt wird in der Mitte eines kleinen Rasterabbildungsbereich durch eine aktive Rückkopplungsmechanismus 2 gehalten.
Die Idee der Verriegelungs, um die Partikel der Boden der Orbitalverfolgungsverfahren. Anstelle von einer Rasterabtastung einer Kreisbahn um den fluoreszierenden Teilchen durchgeführt. Die Intensität der Fluoreszenz entlangdie Umlaufbahn genau lokalisiert die Partikelposition 4.
Die lokalisierte Position des Partikels kann dann verwendet werden, um die Mikroskopscanner und Wieder Zentrum der Umlaufbahn von der Partikelposition zu betätigen. Die Galvanometer-Scannern des Mikroskops durch eine analoge Spannung angetrieben. Die Wechselstromkomponente dieser Spannung ermöglicht die Durchführung einer Umlaufbahn mit dem fokussierten Laserstrahl, dh einer Sinus und einer zur X und Y Scanspiegel angewendet wird es Durchführen einer kreisförmigen Umlaufbahn Kosinuswelle. Der Gleichstrom-Offset des Signals erleichtert das Ändern der Position der Bahn entfernt. Sobald eine Umlaufdauer bestimmt wird und die Wellenform des Wechselspannungssignals konfiguriert ist, muss das Rückführsystem, um nur die DC-Komponente des Signals zu aktualisieren.
Eine Software in der Lage, die von den Detektoren gesammelten Fluoreszenzsignal ausgelesen wird benötigt, um die Scanner und den Detektoren zu steuern, um die Position des Teilchens zu berechnen und zu aktualisieren, die DC ausgesetzt. Für eine erfolgreiche Rückmeldung Abbilden einer sorgfältigen Auswahl der Bahndaten (Größe und Timing) erforderlich ist, und diese Parameter auf der Basis der Eigenschaften der Leuchtstoffpartikel, die es notwendig, zu verfolgen ist, eingestellt werden.
Die physikalischen und mathematischen Grundlagen der Technik wurden in der Vergangenheit 4,5 für 2D-und 3D-Anwendungen beschrieben. In diesem Protokoll beschreiben wir kurz die wesentlichen Hardware-Komponenten der Einrichtung, und genauer die Wahl der Parameter und die Probenvorbereitung für einen typischen Versuch erlaubt uns folgende Verschiebung eines Lysosom mit hoher zeitlicher Auflösung in einer lebenden Zelle erforderlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz der enormen Fortschritte der Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Instrumente in den letzten Jahren erreichen Bahnen der fluoreszierenden Teilchen in drei Dimensionen mit einer hohen zeitlichen Auflösung ist eine Herausforderung im Bereich geblieben. Wenn hohe zeitliche Auflösung wurde Tracking Teilchen in zwei Dimensionen erreicht, die Erweiterung zu der axialen Richtung führt typischerweise zu einer drastischen Reduktion der Frequenzgang des Systems 10.
In diesem Video-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
Riferimenti
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
