Hurtig analyse af kromosomafvigelser i Mouse B lymfocytter ved PNA-FISH
Summary
DNA-reparation veje er afgørende for opretholdelse af genomisk integritet og forhindre mutation og kræft. Målet med denne protokol er at kvantificere genomisk ustabilitet ved direkte observation af kromosomafvigelser i metafasespredninger fra muse-B-celler ved hjælp af fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) til telomeriske DNA gentagelser.
Abstract
Defekt DNA-reparation fører til øget genomisk ustabilitet, som er den egentlige årsag til mutationer, der fører til tumorigenese. Analyse af hyppighed og type af kromosomafvigelser i forskellige celletyper tillader defekter i DNA-reparation veje til at blive belyst. Forståelse pattedyr DNA-reparation biologi er blevet stærkt hjulpet af produktion af mus med huller i specifikke gener. Målet med denne protokol er at kvantificere genomisk ustabilitet i mus B-lymfocytter. Mærkning af telomerer anvender PNA-FISH prober (peptidnukleinsyreenheder – fluorescerende in situ hybridisering) letter hurtig analyse af genomisk instabilitet i metafase kromosom opslag. B-celler har specifikke fordele i forhold til fibroblaster, fordi de har normal ploiditet og en højere mitotisk indeks. Kortsigtet kultur af B-celler muliggør derfor præcis måling af genomisk instabilitet i en primær celle befolkning, der er tilbøjelige til at have færre sekundær genetisk mutations, end hvad der typisk findes i transformerede fibroblaster eller patientens cellelinier.
Introduction
Kræft er forårsaget af ophobning af mutationer påvirker gener, som regulerer normal cellevækst. Mutation er en konsekvens af ændringer i strukturen og rækkefølgen af genomet forårsaget af skader på DNA. DNA-beskadigelse kan forekomme gennem en række, herunder exogene midler, såsom ioniserende stråling, og som et biprodukt af normal cellulær metabolisme, såsom spontan deaminering af nukleotidbaser eller skader, der forekommer ved kontakt med reaktive oxygenarter 1.
Selv pattedyrceller i besiddelse af en række reparations aktiviteter, der kan vende DNA skader eller genoprette sekvensen ved brud steder, mutationer alligevel ophobes i hele deres levetid af en celle. DNA-skader kan desuden bidrage til fremadskridende alderdom og tab af styrke af stamceller, to processer, der er forbundet med aldring-associeret sygdom 2. Forståelse reparation af DNA-skader er derfor af central betydning i håndteringen to tegnvæsentlig in dvirknin g spørgsmål i folkesundheden. Stigende tyder på, at pattedyr DNA-reparation veje kan bidrage til udviklingen af kræft cellegenomet 3,4, hvilket gør det endnu mere nødvendigt at forstå de involverede i at undertrykke mutation på det molekylære niveau processer.
Direkte visualisering af kromosomafvigelser er en kraftfuld og kvantitative midler til at bestemme omfanget af genomisk instabilitet i en bestemt celletype. Kondenserede kromosomer fra celler ved metafase kan isoleres og inspiceres ved hjælp af lys eller fluorescerende mikroskopi. Sådanne cytogenetiske tilgange har været i praksis i flere årtier og kan anvendes til at påvise forekomsten af translokationer eller specifikke typer kromosomafvigelser forbundet med tab af DNA reparation aktiviteter. Protokollen egner sig til flere potentielle udvidelser kromosomerne kan mærkes med prober for spektral karyotypering (SKY) eller flerfarvet fluorescerende in situ-hybridisering(MFISH) for at identificere omplantning 5,6. Disse teknikker gør det også muligt hyppigheden af kromosom translokationer og strukturen af komplekse kromosom translokationer, der skal bestemmes, som giver yderligere oplysninger ud over, hvad der er muligt med denne protokol. Alternativt kan sekvensspecifikke prober genereres og anvendes til at teste hyppigheden af DNA-brud på udvalgte genomiske steder 7.
I denne protokol, vi beskriver fremstilling af metafase kromosom spreder sig fra B-lymfocytter. En fluorescens-mærket peptid-nukleinsyre (PNA) probe til telomer gentagelser anvendes, som effektivt markerer telomerer i metafase kromosom spreder Denne protokol har flere fordele. B-celler kan induceres til at vokse ved høje Mitoseindekset så høj kvalitet smørematerialer kan konsekvent fremstilles. B-celler fra genetisk modificerede mus er også langt mindre tilbøjelige til at indeholde sekundære genetiske mutationer, der kan forvirre analysen af bidragetspecifikke gener til genomisk integritet. PNA-FISH tilgang kan afsluttes på én dag, og giver mulighed for mere præcis scoring af kromosombrug. Ved at bruge denne fremgangsmåde, især i kombination med særligt udstyr, der er beskrevet i denne protokol, er det muligt at fremstille meget konsekvent høj kvalitet spænd og hurtigt analysere hastigheden og typen af genomisk ustabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betragtninger aktiverede B-lymfocytter er særligt velegnede til fremstilling af mitotiske kromosom opslag, kan andre celletyper også anvendes. T-lymfocytter deler mange af fordelene ved B-celler, som de kan oprenses fra milt eller lymfeknuder, og har et højt mitotisk indeks, når de stimuleres ved vækst i medium indeholdende passende mitogener 8. Embryonale stamceller (ES-celler) er også velegnet til metafase kromosomanalyse 9. Hvis disse ikke er tilgængelige, kan fibroblastceller anvendes, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud R00 CA160574 (SFB) og ved et fællesskab af Rutgers Bioteknologi Training Program (til SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
