Rapid Analyse av kromosomavvik i Mouse B-lymfocytter ved PNA-FISH
Summary
DNA-reparasjonsbaner er avgjørende for opprettholdelse av genomisk integritet og hindre mutasjon og kreft. Målet med denne protokollen er å kvantifisere genomisk ustabilitet ved direkte observasjon av kromosomavvik i metafase sprer seg fra mus B-celler ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) for telomeric DNA gjentar.
Abstract
Defekt DNA-reparasjon fører til økt genomisk ustabilitet, som er roten årsaken til mutasjoner som fører til tumorigenesis. Analyse av frekvensen og typen av kromosomale aberrasjoner i forskjellige celletyper gjør det mulig defekter i DNA-reparasjonsbaner som skal belyses. Forståelse pattedyr DNA-reparasjon biologi har vært sterkt hjulpet av produksjonen av mus med knockouts i bestemte gener. Målet med denne protokollen er å kvantifisere genomisk ustabilitet i mus B-lymfocytter. Merking av telomerer bruker PNA-FISH prober (peptid nukleinsyre – fluorescerende in situ hybridisering) forenkler rask analyse av genomisk ustabilitet i metafase kromosommarginer. B-celler har bestemte fordeler i forhold til fibroblaster, fordi de har normalt ploiditet og en høyere mitotiske indeksen. Kortsiktig kultur av B-celler gjør derfor nøyaktig måling av genomisk ustabilitet i en primær cellepopulasjon som er sannsynlig å ha færre sekundære genetisk mutasjons enn det som typisk finnes i transformerte fibroblaster eller pasientcellelinjer.
Introduction
Kreft er forårsaket av akkumulering av mutasjoner som påvirker gener som regulerer normal cellevekst. Mutasjon er en konsekvens av endringer i strukturen og sekvensen av genomet forårsaket av skade på DNA. DNA-skade kan forekomme gjennom en rekke prosess, inkludert eksogene midler slik som ioniserende stråling, og som et biprodukt av normal cellulær metabolisme, slik som spontan deaminering av nukleotid-basene eller skader som oppstår ved kontakt med reaktive oksygenforbindelser en.
Selv om pattedyrceller har en rekke reparasjonsvirksomhet som kan reversere DNA skade eller gjenopprette sekvensen ved bruddsteder, mutasjoner likevel akkumuleres i løpet av levetiden til en celle. DNA-skade kan videre bidra til å senescens og tap av potens av stamceller, to prosesser som er forbundet med aldring-assosiert sykdom 2. Forstå reparasjon av DNA-skader er derfor av sentral betydning i møte to significant problemstillinger i folkehelsen. Økende bevis tyder på at pattedyr DNA-reparasjonsbaner kan bidra til utviklingen av kreftcellen genomet 3,4, noe som gjør det enda mer viktig å forstå prosessene som er involvert i å undertrykke mutasjon på molekylært nivå.
Direkte synliggjøring av kromosomale aberrasjoner er en kraftig og kvantitative middel for å bestemme omfanget av genomisk instabilitet i en bestemt celletype. Kondenserte kromosomer fra celler i metafase kan isoleres og inspiseres ved hjelp av lys eller fluoriserende mikroskopi. Slike cytogenetisk tilnærminger har vært praktisert i flere tiår, og kan brukes til å påvise forekomsten av translokasjoner eller bestemte typer av kromosomforstyrrelser assosiert med tap av DNA-reparasjonsvirksomhet. Protokollen gir seg til flere potensielle utvidelser: kromosomer kan merkes med prober for spektral karyotyping (SKY) eller flerfarget fluorescerende in situ hybridisering(MFISH) for å identifisere trans 5,6. Disse teknikkene også aktivere hyppigheten av kromosomtranslokasjoner og strukturen i komplekse kromosomtranslokasjoner som skal bestemmes, noe som gir ytterligere informasjon utover det som er mulig med denne protokollen. Alternativt, kan sekvensspesifikke prober bli generert og anvendt for å teste forekomsten av DNA-brudd ved utvalgte genomiske områder 7.
I denne protokollen beskriver vi utarbeidelse av meta kromosom sprer seg fra B-lymfocytter. En fluorescensmerket-merkede peptid-nukleinsyre (PNA) probe for telomeric gjentakelser er brukt, noe som effektivt markerer telomerer i metafase-kromosomer sprer Denne protokollen har flere fordeler. B-celler kan induseres til å vokse på høy mitotisk indeks, slik at høy-kvalitets sprer konsekvent kan bli produsert. B-celler fra genmodifiserte mus er også mye mindre sannsynlighet for å inneholde sekundære genetiske mutasjoner som kan skamme analysen av bidragetav spesifikke gener til genomisk integritet. PNA-FISH tilnærming kan gjennomføres på en dag, og tillater mer nøyaktig scoring av kromosom pauser. Ved å bruke denne metoden, spesielt i kombinasjon med spesielle utstyr som er beskrevet i denne protokollen, er det mulig å fremstille meget jevn og høy kvalitet og sprer seg raskt å analysere frekvensen og typen av genomisk instabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens aktiverte B-lymfocytter er spesielt egnet til fremstilling av mitotiske kromosom sprer seg, kan andre celletyper kan også brukes. T-lymfocytter har mange av fordelene til B-celler, som de kan bli renset fra milt eller lymfeknuter, og har en høy mitotisk indeks ved stimulering av vekst i medium inneholdende egnede mitogener 8. Embryonale stamceller (ES-celler) er også egnet for metakromosomanalyse 9. Dersom disse ikke er tilgjengelige, kan fibroblastceller brukes, selv om en lengre behandlin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av NIH stipend R00 CA160574 (SFB) og av et fellesskap av Rutgers Bioteknologi Training Program (til SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
