Introduction
Murine modeller har blitt brukt mye i hjerneforskning en. Genotype-fenotype korrelasjoner har blitt undersøkt i mus og rottehjerner ved å studere genekspresjon ved RNA og / eller proteinnivåer på den ene side, og morfologiske, funksjonelle, elektrofysiologiske og / eller adferdsmessige fenotyper på den andre 2-6. Men for å helt forstå mekanismene som knytter fenotype til genotype, er det viktig å undersøke de molekylære hendelser nedstrøms protein uttrykk, altså. metabolismen av de biokjemiske substrater hvorpå enzymer virker 7. Dette kravet førte i løpet av de siste 10 til 15 år, til en renessanse for metabolsk forskning i mange grener av biologien 8,9. Mens klassiske metabolske studier har ofte vært fokusert på detaljer om bestemte veier, er det nye metabolomic tilnærming rettet mot en altomfattende undersøkelse av den globale metabolske profil av vevet under vurdering.En konsekvens av dette konseptet er et åpenbart behov for analytiske verktøy som minimerer bias mot spesifikke metabolske veier og / eller klasser av forbindelser. Det er imidlertid en klassisk biokjemisk analyse basert på en bestemt kjemisk reaksjon på en bestemt analytt som skal spesifiseres før analysen utføres. I motsetning til dette er spektroskopiske teknikker slik som kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og massespektrometri (MS) (i) basert på bestemte molekylære (fysikalske) egenskaper av biokjemiske forbindelser, som hver gir opphav til en eller flere forskjellige signaler i et spektrum påvises i løpet av et eksperiment; og (ii) påvise et stort antall forskjellige forbindelser per eksperiment.
Således inneholder hvert spektrum den kombinerte informasjon fra en rekke metabolitter. Av denne grunn, spektroskopiske metoder er tilstrekkelig verktøy for metabolomikk, da ingen tidligere valg som må gjøres med hensyn til arten av den analytt som skal måles 8
Selv om NMR-spektroskopi og MS kan brukes om hverandre for analyse av mange metabolitter, besitter hver metode spesifikke fordeler og ulemper som nylig har blitt anmeldt 10. Kort, kan NMR-spektroskopi som regel utføres fra rå ekstrakter og krever ikke kromatografisk separasjon av eksempelforbindelser før analyse. I motsetning til dette, virker MS med gass eller væske-kromatografi (GC eller LC) separasjon, med unntak av bestemte nylige utviklinger som massespektrometri avbildning. I noen spesielle tilfeller slik som analyse av sukkerarter, kan LC-separasjon blitt en nødvendighet for NMR-spektroskopi, i tillegg, fordi resonans linjer av forskjellige sukkere overlappe betydelig i proton (1H)-NMR-spektra. Ikke desto mindre, 1H NMR-spektroskopi uten chromatographic separasjon er fortsatt det mest populære, nesten universelt anvendt metabolomic NMR-metoden. Vanligvis er prøvepreparering mer tidkrevende og komplisert for MS enn for NMR-spektroskopi. Alvorlige problemer på grunn av matrix effekter er mye mindre vanlig i NMR-spektroskopi enn i MS der de kan føre til betydelig svekkede signaler. Metabolitt kvantifisering kan oppnås ved en av metodene. Imidlertid er flere vanlige forbindelser som er nødvendig for MS på grunn av variasjoner i matrise effekter og ionisering effektivitet mellom metabolitter. I motsetning til dette, er det kun én standard per prøve nødvendig for en NMR-spektroskopisk analyse fordi under egnede måleforhold, er den sistnevnte metode egen kvantitative takket være strengt lineær NMR respons ved de observerte kjerner. En stor ulempe med NMR er dens relativt lav følsomhet. MS, spesielt LC-MS, er mer følsom enn NMR av flere størrelsesordener; på grunn av dette, er MS å foretrekke fremfor NMR foranalyse av forbindelser som forekommer i meget lave konsentrasjoner. På den annen side er den ikke-destruktiv naturen av NMR-eksperimentet en klar fordel i forhold til MS; på denne måten, kan NMR utføres gjentatte ganger på den samme prøve, for eksempel for forskjellige NMR-aktive kjerner som for eksempel 1H, fosfor-31 (31 P), karbon-13 (13 C), fluor-19 (19 F) el. da ingen vesentlige er forbrukt ved hjelp av NMR i motsetning til MS-målinger.
Både NMR og MS kan anvendes i forskjellige modi, hver av dem å være optimal for påvisning av forbindelser med bestemte kjemiske karakteristika. For eksempel er 31 P NMR ofte bedre egnet enn 1 H NMR for analyse av moderat konsentrerte fosforylerte forbindelser, selv om nesten alt fosforylerte metabolitter også inneholder protoner. Imidlertid kan deres 1 H NMR-signaler være skjult av en H NMR-signaler fra andre, ikke-fosforylerte forbindelser, mens den sistnevnteselvsagt ikke forårsake bakgrunnssignaler på 31 P-NMR-spektra. I en analog situasjon, er 19 C NMR-analyse å være foretrukket for fluorholdige forbindelser, f.eks, fluorholdige midler (ingen bakgrunnssignaler fra endogene metabolitter), mens det spesielle tilfelle av 13C NMR er av interesse nesten utelukkende dersom skjebnen til 13 C- merkede eksogene metabolske forløpere må følges, på grunn av den ekstremt lave naturlige overflod av 13 C isotop (ca. 1%). Mange massespektrometre jobbe i enten negativ ion-modus eller positiv ion modus. Derfor er det viktig å vite forut for analysen enten ionene som skal overholdes er negativt eller positivt ladet. Vi fokus her på en protokoll for analyse av hjernevevet metabolomet ved 1H og 31 P-NMR-spektroskopi, fordi denne metode gir et stort antall viktige metabolittkonsentrasjoner til lave kostnader i form av (i) tiden som er nødvendig for prøvepreparering ennd (ii) innsats som kreves for metabolitten kvantifisering. Alle eksperimenter kan utføres ved hjelp av utstyret av en standard våt-kjemi laboratorium og en høy oppløsning NMR-spektroskopi anlegget. Ytterligere krav er beskrevet i protokollen nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dyreetikk UTTALELSE
Dyrestudier på rotter fulgt retningslinjene som gjelder i Frankrike, og ble godkjent av den lokale etikkutvalget (# 40.04, Universitetet i Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankrike).
1. Høsting og Frysing Rat Brain
- Forbered elementer som kreves flytende nitrogen (N 2liq.) I Dewar som er stor nok til å holde en fryse klemme (minst 2-3 l volum); bedøvelse (f.eks, isofluran, eller ketamin / xylazin); anestesi kammer; sterile disseksjon verktøy: kirurgiske saks, skalpell, tang; vev kluter og flaske med rengjøring alkohol (etanol); nåler (25 g); 1 ml og 10 ml sprøyter. Etiketten aluminiumsplater (ca 10 x 10 cm) med klebrig tape. Bruk ark å vikle individuelle fryse klemt rottehjerner.
MERK: Bruk alltid vernehansker og vernebriller briller eller maske ved håndtering av flytende nitrogen! - Fyll Dewar med N 2liq. Og plassere gratisZing klemme i en Dewar. Kontroller at mengden av N 2liq i Dewar er tilstrekkelig for gjentatte fryse-clamp prosedyrer (flere liter; mengden av N 2liq fordamper i løpet av hver fryse-fastspenning er avhengig av størrelsen av klemmen).
- Bedøve dyr (for eksempel ved isofluran, eller ved intraperitoneal injeksjon av en ketamin / xylazin blanding). Fortsett til aktiv dødshjelp ved hjertepunktur å hindre blødning når hodebunnen er fjernet og kraniet åpnet. Steps 1.4 til 1.7 nedenfor beskriver dette standard prosedyre.
MERK: I spesielle protokoller som krever maksimal bevaring av glukose og høy energi metabolitter, offer rotte av trakt-frysing hjernen bedøvet dyret med N 2liq 11 etter tilbaketrekkingen av hodebunnen. Deretter dissekere hjernen ut av skallen etter intermitterende N 2liq å redusere post-mortem metabolisme 12. - Fukt leder av rotte med rengjøring alkohol. Bruk kirurgisk saks til (i) remove hodebunnen, og (ii) åpne skallen sammen kraniale suturer.
- Bruk pinsett til å åpne skallen videre, og for å fjerne hele hjernen fra under den åpne hodeskallen, posisjonere hodet opp ned. Fjern raskt noen synlige spor av blod ved hjelp av vev våtservietter. Hvis hjernehalvdelene er metabolsk og morfologisk symmetrisk, er det praktisk å bruke en av de halvkuler for metabolsk analyse etter skille det fra den andre halvkule ved innsnitt med skalpellen. Hvis det er nødvendig, bruke den gjenværende halvkule for andre hjernen studier som histologi.
- Raskt fjerne frysing klemmen fra N 2liq -filled Dewar, plassere hele eller halve rottehjernen på en indre overflaten, klemme og umiddelbart sette frysing klemme inn N 2liq -filled Dewar mens du holder klemme fast komprimert. Sørg for at trinn 1,3-1,6 ta lenger enn 60 sek.
- Etter 1-2 min remove frysing klemmen fra Dewar, åpen klemme, løsne frosne hjernevev fra klemmen og wrapfrosne vev i hensiktsmessig merket aluminiumsplate (se 1.1 ovenfor). Pass på at etiketten er leselig og holder seg godt på plass etter at prøven er innpakket. Raskt plassere innpakket prøve i N 2liq. Utfør hele prosedyren så fort som mulig for å unngå tining av frossen hjernevev.
- Oppbevare dypfryste prøve i N 2liq eller i en fryser ved -80 ° C inntil metabolitt utvinning.
MERK: Når en biologisk prøve som skal lagres i mer enn ett år, er lagring ved N 2liq temperatur for å bli foretrukket over -80 ° C. Dette gjelder også for resten av denne protokoll.
2. Utarbeidelse av Metabolitt Utvinning Prosedyre
- Forbered vev-homogenisator og samsvarende reagensglass (f.eks, 10 mm indre diameter, avhengig av diameteren av homogenisatoren akselen, vanligvis laget av plast). Bruk elektriske homogenizers snarere enn manuelt drevne homogenizers (vev kverner). PrePare vortex og laboratorie balanse.
- Forbered bøtte fylt med knust is. Hold tilstrekkelig quantitites av metanol, kloroform og vann på is (4 ml hver pr 250-350 mg frossen hjernevev).
- Forbered Overføringspipetter og hetteglass.
- Forbered hetteglass (≥20 ml volum) med skrukork og legg på is (ett hetteglass per vevekstrakt). Fit skrulokk med en Teflon septa motstandsdyktig mot kloroform.
- Forbered 5 ml plastpipetter for dispensering av metanol og vann, og glass pipetter eller Hamilton sprøyter for utlevering av kloroform. Forbered ytterligere plastpipetter (5 eller 10 ml volum) for å overføre blandinger av vev homogenat og metanol.
- Kontroller at alt glass er grundig skylt med destillert vann og omhyggelig tørket før bruk for å fjerne spor av urenheter, spesielt NMR-påviselig formiat og acetat.
- Fyll porselen mørtel med N 2liq, sted porselen støter i morter og fyll med N 2liq. Nitrogen vil fordampe inntil temperaturen i morter er tilstrekkelig lav. Hold liten mengde N 2liq i mørtel.
3. Utvinning av metabolitter
- Fjern frosne hjernen vevsprøve fra lagring (N 2liq tank eller -80 ° C fryser). Deretter umiddelbart overføre vevsprøve til mørtel delvis fylt med N 2liq.
- Bruk N 2liq -kald stampe å bryte den frosne hjernevev i mindre biter som lett passer inn i reagensglass som brukes for vev homogenisering. For å hindre at stykker av frosset vev fra å bli anslått av mørtelen i prosessen, bryte opp vevet mens det fremdeles blir innpakket i aluminiumsplate. Ikke slip frosne vev til pulveret, da dette ville gjøre overføring til reagensrør vanskeligere (økt risiko for kondensvann). VIKTIG: Gjennom hele prosedyren, legg N 2liq til mørtel som trengs for å holde prøven dypt frosset.
- Mix small biter av frossen hjernevev grundig, veie 250-350 mg og overføre til et reagensrør fylt med iskald metanol (4 ml til 250-350 mg hjernevev). Hver gang biter av frossen vev er lagt til, homogenisere disse umiddelbart med vevshomogenisator.
MERK: full hele denne prosedyren raskt for å unngå (i) vesentlig kondensering av vann på prøven som ville føre til en overestimering av prøvevekten, og (ii) oppvarming og tining av prøven. Individuelle delsstykker bør være i en frossen tilstand ved begynnelsen av homogenisering prosessen. - Etter at den siste del av den frosne rottehjerne prøven er blitt tilsatt til testrør og homogenisert, overføre homogenatet til en ≥20 ml volum hetteglass, tett skrukork og la stå på is i 15 min. Hvis volumet av testrøret ikke er tilstrekkelig stor for ≥4 ml metanol, bruke et mindre volum metanol for å homogenisere en del av den frosne hjernevev, overføre blandingen tilhetteglass og fortsette homogenisere de gjenværende vev stykker med fersk metanol. Kontroller at den totale metanol volumet er 4 ml per 250-350 mg hjernevev.
- Tilsett samme volum iskald kloroform (dvs. 4 ml per 250 til 350 mg hjernevev) til homogenat, vortex grundig og lar stå på is i 15 min.
MERK: Bruk alltid ventilert kjemisk hette ved håndtering av flyktige løsemidler, særlig kloroform! - Tilsett samme volum av vann (dvs. 4 ml per 250 til 350 mg hjernevev) til homogenat, vortex grundig og lar stå ved -20 ° C over natten.
4. Utarbeidelse av faseseparasjon og Solvent Evaporation
- Forbered kaldt sentrifuge (4 ° C, 13.000 x g ved maksimal radius) og sentrifugerør. Sørg for at sistnevnte er ≥20 ml volum, motstandsdyktig mot kloroform, og tåler sentrifugale krefter 13000 x g. Bruk glass sentrifugerør men skyll (som alle glass ware) med destillert vann væreforgrunnen bruk (se 2.3).
- Forbered grundig skylt glass Pasteur pipetter og en passende propipettor (pære, manuell pipette pumpe, automatisk pipette hjelpemiddel / pipette, etc.).
- Forbered to ekstra grundig skylt rør (≥15 ml volum) pr hjerneprøve, hvorav den ene må være motstandsdyktige mot kloroform (fremstilt av glass eller teflon), den andre til metanol (laget av plast resistente overfor metanol, eller glass).
- Forbered løsemiddel fordampning apparat (kommersielt tilgjengelig eller homebuilt). Påse at denne enhet gir en fint kontrollert strøm av tørr nitrogengass som rettes mot overflaten av en ekstraktløsning inneholdende flyktige løsningsmidler (metanol, kloroform).
- Forbered to ekstra skuffer eller bøtter fylt med is: en for prøve transport på is, og en annen for å holde prøvene kalde under fordampning prosessen.
- Forbered fryse-tørreren (fryse-tørker) og materialer som er nødvendig for lyofilisering: (i) en 50ml sentrifugerør eller vakuum, rundbunnet kolbe per ekstrakt, og (ii) N 2liq å fryse den vandige fase av prøvene (≤0.3 L per prøve). Hvis sentrifugerør brukes, også forberede bredhalsede vakuumfilterflaske egnet for fryse-tørreren.
5. Fase Separasjon og Solvent Evaporation
- For fullstendig faseseparasjon, overføre metanol / kloroform / vann / hjernevev homogenat (se 3.6) til en kloroform-resistente sentrifugerør (≥20 ml volum) og sentrifuger ved 13 000 xg og 4 ° C i 40 min.
MERK: To faser vil dannes, adskilt av et lag av utfelt protein. Den nedre (tyngre) fase består av metanol, kloroform og oppløste lipider, mens den øvre (lysere) fase består av vann, metanol og oppløste vannløselige metabolitter. - Bruk en Pasteur-pipette for å overføre den øvre fase til en passende ≥15 ml rør (plast resistente overfor metanol, eller glass). Hold på ice.
- Bruk ny Pasteur pipette for å overføre den nedre fase til en passende ≥15 ml rør (glass eller teflon). Hold på is.
- Oppbevar lag av utfelt protein ved -80 ° C hvis den skal brukes for bestemmelse av totalt protein; ellers forkaste.
- Hold røret med vann / metanol-fase (se 5.2) på is og fordampe metanol ved å rette en tørr nitrogenstrøm på overflaten av ekstraktet løsning. Alternativt forsiktig boble nitrogen gjennom løsningen ekstrakt. Avslutt fordampningsprosessen når nitrogen boblende ikke lenger forårsaker volumreduksjon i ekstraktet løsning. På dette tidspunkt fortsetter med lyofilisering (se 5.7), eller fryse og holde prøven ved -80 ° C med røret lukket (skrulokk eller Parafilm) inntil de er klare for lyofilisering.
- Plasser røret med metanol / kloroform-fase (se 5.3) på is og fordampe metanol ved å rette en tørr nitrogenstrøm på det surface av ekstrakt-løsning. Når alt oppløsningsmiddel er fordampet, avslutte prosessen og holde prøven ved -80 ° C med røret lukket (skrulokk eller Parafilm) inntil de er klare for NMR-analyse.
- Forbered vannfase for Lyophilization
- Etter slutten av metanol fordampning prosessen (se 5.5), overføre prøven til en grundig skylt 50 ml sentrifugerør (hvis prøven er frosset, tine før overføring). Alternativt, overføring til et vakuum rundbunnet kolbe.
- Fryse-ekstrakt-løsning ved å rotere sentrifugerør (eller rundbunnet kolbe) delvis innsatt i N 2liq slik at den indre overflate av røret eller kolben blir progressivt dekkes av frossen væske. Pass på at ingen N 2liq. Kan gå inn i stikkontakten.
- Når all væsken er frosset, dekke rør med en punktert lokk eller skrulokk for å tillate damp å unnslippe, og plassere røret i en bredhalsede vakuumfilterflaske.
- Begynn lyofiliseringen etter attaching kolben eller flaske til fryse-tørketrommel.
- Avslutt lyofiliseringsprosessen når prøven er fullstendig tørr. Holde prøven ved -80 ° C i et lukket rør (med en tett lokk!) Inntil anvendes for NMR-analyse.
MERK: vanligvis ikke mer enn 24 timer er nødvendig for lyofilisering. Flere prøver kan lyofiliseres samtidig, avhengig av utformingen av fryse-tørreren, og om hvorvidt sentrifugerør i bredhalsede flasker eller rundkolber benyttes.
6. Utarbeidelse av NMR Samples
- Butikken tørket og frysetørkede ekstrakter ved svært lav temperatur (≤-80 ° C). Re-oppløse lyophilizates for utarbeidelse av NMR prøvene umiddelbart før NMR eksperiment.
MERK: Lagring av prøver i løsning og / eller nær romtemperatur kan resultere i utvalget degradering! - Tilbered en vandig 200 mM oppløsning av det chelaterende middel, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic syre (CDTA), som følger:
- Legg rent vann (f.eks, 20 ml) i et testrør eller sentrifugerøret, og legg til mengden av pulver CDTA er nødvendig for å generere en 200 mM oppløsning.
MERK: En betydelig andel av CDTA ikke vil være oppløselige, fordi pH er svært lav, siden syreformen av CDTA ble brukt i stedet for en CDTA salt. - Tilsett forsiktig, trinn for trinn, økende mengder CsOH pulver til CDTA løsning, og virvle grundig etter hvert tillegg.
MERK: oppløselig CDTA fraksjon vil øke med økende CsOH-innhold i den vandige oppløsning. Unngå "overtitration", det vil si legge til mindre enn den støkiometriske mengde av CsOH til CDTA løsning. - Når nesten alle CDTA pulveret er oppløst, begynne å måle pH etter hver CsOH tillegg og grundig virvling. Avslutt CsOH tillegg når den endelige pH-verdi er nådd (tabell 1).
MERK: På denne tiden, vil alle CDTA bli oppløst. Bruken av Cs + som et mot-ion til CDTA er genealliert foretrukket over Na + eller K +. Cs + er en myk Lewis-syre på grunn av sin store ionisk radius, i motsetning til Na + og K + som har mindre ionisk radius og er harde syrer. Følgelig Cs + danner komplekser med fosfater (hard baser) mindre lett enn gjør Na + og K +. Dette er en fordel for 31 P NMR-spektroskopi av fosforylerte metabolitter fordi kompleks tendens til å øke NMR linewidths, spesielt under forhold med langsom til middels ionebytte.
- Legg rent vann (f.eks, 20 ml) i et testrør eller sentrifugerøret, og legg til mengden av pulver CDTA er nødvendig for å generere en 200 mM oppløsning.
- For 31 P NMR analyse av fosfolipider (PL), oppløse tørkede lipider (se 5.6) i 700 pl av en løsningsmiddelblanding bestående av deuterert kloroform (CDCI3), metanol og CDTA oppløsning fremstilt som beskrevet i 6.2 (5: 4: 1 volum-forhold). Overfør prøven til et mikrosentrifugerør. Bruk direkte fortrengning (eller fortrengnings) mikropipette med kloroform-motståmaur tips i begge trinnene.
MERK: Husk at å endre noen av følgende parametre vil påvirke utseendet (kjemisk skift og linjebredder) av PL 31 P NMR spektra 13-17:
(I) volumforhold CDCl3: MeOH: CDTA løsningen
(Ii) total oppløsningsmiddel-volumet benyttes
(Iii) pH av den vandige komponent i løsningsmidlet
(Iv) CDTA konsentrasjonen av den vandige komponent i løsningsmidlet.
MERK: Generelt finjustering av disse parametre (Tabell 1) er ikke nødvendig, og bør utføres med ekstrem forsiktighet hvis ønskelig i spesielle tilfeller. Endring av volumforholdet mellom oppløsningsmidler lett resulterer i dannelsen av et system bestående av to faser i stedet for en homogen fase! Den ene-fase-systemet ble funnet å være mer praktisk enn den to-fase-system i de fleste applikasjoner 13,14. - For 1 H NMR-analyse av vannløselige metabolitter, oppløse lyofilisat (se 5.8) i 700 pl deuteriumoksyd (D 2 O) inneholdende 3-(trimetylsilyl)-propionsyre 2,2,3,3-d4-syre-natriumsalt (TSPd 4) i millimolar område (D 2 O inneholdende 0,05% TSPd 4 er kommersielt tilgjengelig) . Overfør prøven til et mikrosentrifugerør.
- Juster pH-verdien til den resulterende vandige ekstrakt-løsning til 7,3 ved tilsetning av små mengder (ca. 2 mL) av deuterium-klorid (DCl) og natrium deuteroxide (NaOD) løsninger. Først, start med 0,02 N DCL eller NaOD løsninger. Hvis to eller tre senere tillegg ikke føre tilstrekkelig pH forandring, fortsett med 0,2 N DCL eller NaOD løsninger. Vær forsiktig så du ikke overtitrate.
MERK: Den samlede mengden av DCl eller NaOD løsning som trengs avhenger av mengden av hjernevev hentet; merk denne verdien for presis metabolitten kvantifisering. I de fleste tilfeller ble de kombinerte mengder av de tilsatte DCL og NaOD løsninger bør være praktisk talt ubetydelig (nær 1% av NMR-prøvevolum).
- For best resultat, bruk en multinukleært høyoppløselig NMR spektrometer (≥9.4 Tesla feltstyrken, tilsvarende 162 MHz 31 P, eller 400 MHz 1 H resonansfrekvenser). Foruten de 31 P coil, sørge for at 31 P NMR probe besitter en 1 H spole for proton dekobling. Sett temperaturregulering av NMR-sonden til ønsket mål verdi (vanligvis 25 ° C).
MERK: Probe temperatur kan trenge 10-20 min å stabilisere! - Sentrifuger PL ekstrakt løsning i mikrosentrifugerør (se 6.3) ved 4 ° C og 11.000 x g i 30 min for å spinne ned faste rester i prøven. Overfør 600 ul av supernatanten til en høy kvalitet NMR-rør (5 mm ytre diameter).
- Forbered passende koaksial Sett spindel fylt med en vandig 20 mM methylenediphosphonate (MDP) løsning ved pH 7,0 for kjemisk-shift henvisningog kvantifisering. Plasser denne innsatsen i NMR rør fylt med PL ekstrakt løsning.
- Monter NMR rør med passende spinner og overføring til NMR-magnet. Nå spinne prøven ved 15-20 Hz og vente inntil prøven er regulert til den innstilte temperatur (ca. 10 min).
- Minimere magnetisk-feltet inhomogenitet over prøven forsiktig ved å justere på-aksen og off-axis mellomlegg spiral strømninger 18.
- Sett NMR-spektrum innhentingsparametere til optimale verdier, som kan variere som en funksjon av magnet feltstyrke (for en 9,4 T-systemet, se tabell 1 for anbefalte parameterverdier).
- Sett antall transienter per eksperiment (= NS).
- Sett NS til ca 80 (total varighet på datainnsamling ca. 20 min) hvis bare de mest utbredte PL skal kvantifiseres med presisjon (phosphatidylcholine (PtdCho), fosfatidyletanolamin (PtdEtn), etanol plasmalogen).
- Sett NS til ca 100-200 (total varighet på data anskaffelse 1-2 timer) hvis mindre konsentrerte PL skal kvantifiseres (alkyl-acyl-fosfatidylcholin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin, fosfatidinsyre).
- Sett NS til ca 1,500-2,000 (total varighet på datainnsamling 7-10 hr; natten eksperiment) hvis very-low-konsentrasjons PL skal kvantifiseres, f.eks phosphatidylinositol mono og diphosphates (PtdIP og PtdIP 2), cardiolipin, lyso-PL , alkyl-acyl-fosfatidyletanolamin, og av og til andre.
- Etter utløpet av spekteret oppkjøpet, prosess induksjonsråte (FID) med optimaliserte parametere. Verdiene av disse parametrene varierer som en funksjon av magnetisk feltstyrke, mellomlegg kvalitet, og PL signal som skal kvantifiseres.
- For å oppnå best mulig resultat for hele spekteret av pls, gjenta behandling ved hjelp av flere (minst to) ulike filtreringsprosedyrer. Bruk sterk oppløsning ekstrautstyr for sterkt overlappende signaler, f.eks., For PtdCho og PtdEtnregioner.
- Bruk sterk filtrering (svak eller ingen oppløsning ekstrautstyr) for svake signaler.
- Filtrer meget svake og brede signaler uten vesentlig overlapping av apodization (for eksempel LB = 3 Hz) for å øke signal-til-støy-forhold, f.eks PtdIP og PtdIP 2. Se tabell 1 for karakteristiske prosessparametere.
- Tall arealet av hver PL signal med hensyn til arealet under signalet fra referanseforbindelsen (MDP) i det samme spekteret.
- Kalibrer signalet fra referanseforbindelsen (MDP) i et separat eksperiment, ved bruk av et 5 mm NMR-rør fylt med (i) en fosforforbindelse av kjent konsentrasjon, og (ii) det samme koaksiale innsatsen stammen benyttet i PL 31 P NMR eksperimenter ( se 7.3 og 7.9).
- Beregn individuelle PL konsentrasjoner basert på relative områder av PL-signaler på den ene side (se 7.9) og på kalibreringsverdi oppnådd for MDP frakoaksial innlegget på den andre (se 7.10). Ta i betraktning at antallet av fosforkjerner som bidrar til en bestemt 31 P-NMR-signalet kan variere som en funksjon av den molekylære opprinnelsen av det signal.
MERK: MDP phosphonate signal (vanligvis referert til 19.39 ppm) representerer to fosfor kjerner, som gjør cardiolipin fosfat signal. Alle andre PL 31 P NMR skredtatte i hjernen ekstrakter representerer ett fosfor kjernen hver. - Bruke statistikk programvare som trengs for å sammenligne hjernen PL nivåer mellom grupper av dyr.
8. Gjennomføring av 1H NMR eksperiment for analyse av vannløselige Brain Metabolitter
- Sett temperaturregulering av 1H NMR-probe til target ønsket verdi (vanligvis 25 ° C). Bemerker se også 7.1.
- Sentrifuger den vandige ekstrakt løsning i mikrosentrifugerør (se 6.5) ved 4 ° C og 11000xg i 30 min for å spinne ned faste rester i prøven. Overfør 600 ul av supernatanten til en høy kvalitet NMR-rør (5 mm ytre diameter).
- Transfer NMR rør til NMR magnet, mellomlegg og satt NMR spektrum oppkjøps parametre til optimale verdier som forklart i 7.4 til 7.6. Se også tabell 1 for anbefalte parameterverdier.
- Angi antall transienter per eksperiment for å om NS = 32 (total varighet på datainnsamling ca. 13 min). Å få gode signal-til-støy-forhold for svært svake signaler, spesielt i den aromatiske regionen, bruker NS = 64 (total varighet på datainnsamling ca. 26 min) eller mer.
- Etter utløpet av spekteret oppkjøpet, prosess induksjonsråte (FID) med optimaliserte parametere. Verdiene av disse parametre variere noe som en funksjon av magnetfeltets styrke, mellomlegg kvalitet, og metabolitten signalet som skal kvantifiseres.
MERK: I de fleste tilfeller er det tilstrekkelig å behandle hver spektrum gang, Sysselsetter et sett av prosessparametere presentere et godt kompromiss for alle metabolitt signaler. Se tabell 1 for karakteristiske prosessparametere. - Tall arealet av hver metabolitt signal (ofte en multiplett, noen ganger overlapp med andre singlets eller multipletter som stammer fra forskjellige molekyler) med hensyn til arealet under signalet fra referanseforbindelsen (TSP-d 4) i det samme spekteret.
- Kalkulerer individuelle metabolittkonsentrasjoner basert på TSP-d 4 konsentrasjon (se 6.4). Ta i betraktning at det antall protoner som bidrar til en bestemt 1H NMR-signalet kan variere som en funksjon av den molekylære opprinnelsen av det signal. TSP-d 4 trimetyl signal (referert til 0,0 ppm) representerer ni protoner.
- Bruke statistikk programvare som trengs for å sammenligne hjernen metabolitter mellom grupper av dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå best mulig oppløsning i metabolsk NMR spektra av hjernen og andre vev ekstrakter, har det lenge vært vanlig praksis å fjerne eller maske metallioner (viktigst: paramagnetiske ioner) til stede i ekstrakt løsninger. Dette har blitt oppnådd enten ved tilsetning av et chelateringsmiddel så som EDTA eller CDTA til ekstraktet 19, eller ved å føre ekstrakten gjennom en ionebytterharpiks, for eksempel Chelex-100 20. Resultatene som er presentert i figur 1 viser at dette trinnet er ikke nødvendig for 1H NMR spektroskopisk analyse dersom hjerneekstrakter er nøye fremstilt i henhold til ovennevnte protokoll. Her ble ekstremt smale spektrallinjer innhentet for alle spektrale regioner analysert. Selv i svært overfylte regioner, f.eks, for glutamin / glutamat og myo-Inositol / glysin, topper på en avstand på <0,01 ppm er nesten helt separable på 400 MHz (Figur 1, nederst). Som en konsekvens, kvalitative,og kvantitativ analyse av de mange små, men foreløpig ufordelte, topper synlige i sentrum og bunnplater av figur 1 kan tenkes i fremtiden.
Figur 1. Underområder av en typisk 1H NMR-spektrum (400 MHz) av den vandige fase av en hjernevev ekstrakt fra en hunn Lewis rotte. Alle tre paneler demonstrere ekstremt høy oppløsning kan oppnås ved hjelp av den protokoll som presenteres i denne papir. Verken chelaterende middel eller ionebytteharpiks har vært brukt under tillagingen. Center og bunnplater viser at det foreligger mange ufordelte lav intensitet topper som hint på det enorme dynamiske området dekket av høy oppløsning 1H NMR-spektroskopi av vevsekstrakter hvis utført ved hjelp av optimaliserte eksperimentelle parametre. Disse svak, men godtdetekterbare signaler kan potensielt bli identifisert og kvantifisert i fremtiden. Flere påviste metabolitter er bestemt av hjernevev, for eksempel nervecellen markør NAA eller signalstoffet GABA.; Imidlertid er de fleste forbindelser som er involvert i et bredt spekter av metabolske veier som er felles for pattedyrceller, slik som aminosyre, forgrenede organisk syre, polyol, (fosfo) lipid og energimetabolisme, så vel som i glykolysen og glutaminolysis, og i funksjoner som osmoregulering, cellevekst og proliferasjon. Stjernen angir metyl resonans stammer fra en metanol urenhet. Forkortelser: ala, alanine; lac, laktat; treo, treonin; BHB, β-hydroksybutyrat; val, valin; ile, isoleucin; leu, leucin; AAB, α-aminobutyrate; AHB, α-hydroxybutyrate; Tau, taurin, SCY -Ins, scyllo Inositol; Myo -Ins, myo-Inositol; GPC, glycerophosphocholine; PC, phosphocholine; cho, choline; CRN, kreatinin; Cr, kreatin; GABA,47; -aminobutyrate; asp, aspartate; NAA, N -acetylaspartate; GLN, glutamin; Glu, glutamat; SUC, succinate; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acetat; Gly, glycin. De små topper på bunnen av ala dublett stammen fra den laktat 13 C satellitt dublett (topp-panelet). Gjengitt under Creative Commons Attribution License (Ccal) termer fra Lutz NW et al (2013) Cerebral biokjemiske mekanismer i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt og adjuvant leddgikt:. En komparativ metabolomic studie. PLOS ONE 8 (2):. E56101 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I 31 P NMR-spektroskopi, maskering eller fjerne paramagnetiske kationer (hovedsakelig jern) er utvilsomt en nødvendighet, fordi fosfater lett danne komplekser med toverdige og treverdige ioner. Tilsetting av CDTA utdrag påvirker både spektral linje bredder end kjemisk skift; sammenligne Figur 2, topp og bunn venstre. Linje innsnevring ved å velge 1000 mm (nederst til venstre) i stedet for 200 mm (øverst til venstre) CDTA ble ønsket, men resulterte i superposisjon av PL signaler som bør kvantifiseres separat (øverst til venstre). Derfor er 200 mM CDTA anbefales for den vandige komponenten av PL løsningsmiddel, alle andre betingelser er like. Videre prøvetemperaturen under målingen påvirker spektrale linjebredder og kjemiske skift; sammenligne Figur 2, topp og nederst til høyre. Linje innsnevring ved å velge 277 K (nederst til høyre) i stedet for 297 K (øverst til høyre) ble ønsket, men resulterte i superposisjon av PL signaler som bør kvantifiseres separat (øverst til høyre). Derfor er 297 K anbefalt som måletemperaturen, alle andre betingelser er like. Sammenligning mellom de to øverste panelene viser at en nedgang i CDTA konsentrasjon fra 200 mm (øverst til venstre) til 50 mm (øverst til høyre) bare resulterer ien beskjeden økning i linjebredde, og i nesten ingen endring i kjemisk skift. Vær imidlertid oppmerksom på at vevet konsentrasjonen i 50 mM CDTA ekstrakt er halvparten så høyt som det er i 200 mm CDTA ekstrakt, forklarer de relativt smale linjer i øvre høyre panel 13.
Figur 2. Fosfatidyletanolaminsyntese (PtdE) regioner av fosfolipid 31 P NMR spektra (162 MHz) av hjernevevet utdrag fra kvinnelige Lewis rotter (øverst til venstre panel) Brain vevskonsentrasjon, 236 mg / ml.; CDTA konsentrasjon og pH i den vandige komponent i løsningsmidlet, 200 mM, og 7,33, henholdsvis; temperaturmåling, er 297 K. PtdE plasm og SM signaler godt løst (nederst til venstre) Brain vevskonsentrasjon, 236 mg / ml.; CDTA concentration og pH i den vandige komponent i løsningsmidlet, 1,000 mM og 7,36, henholdsvis; temperaturmåling, 297 K. PtdE plasm og SM signalene overlapper helt; de kan ikke løses til tross for redusert linjebredde, sammenlignet med toppen venstre spektrum (øverst til høyre) Brain vevskonsentrasjon, 118 mg / ml.; CDTA konsentrasjon og pH i den vandige komponent av løsningsmidlet, 50 mM og 7,14, henholdsvis; måletemperatur, 297 K. PtdE og SM-signaler er godt løst (nederst til høyre) Hjernevev konsentrasjon 118 mg / ml.; CDTA konsentrasjon og pH i den vandige komponent av løsningsmidlet, 50 mM og 7,14, henholdsvis; temperaturmåling, 277 K. PtdE og SM signalene overlapper helt; de kan ikke løses, til tross for redusert linjebredde i forhold til øverst til høyre spekteret. Forkortelser: PtdE plasm, etanol plasmalogen; PtdE, fosfatidyletanolamin; SM, sfingomyelin; PtdS, phosphatidylserine; PTDC, phosphatidylcholine. Gjengitt med tillatelse fra Lutz NW et al. (2010) Multiparametric optimalisering av 31 P NMR spektroskopiske analyser av fosfolipider i råolje vevsekstrakter. 1. Kjemisk skift og signalseparasjon. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ved hjelp av ovennevnte protokoll (én-fasesystem 14, figur 3, øverst til venstre), et stort antall målbare PL ble påvist (figur 3, øverst til høyre), som dekker en betydelig konsentrasjonsområde (merk avkortede høyintensive signaler). Noen av disse signalene er foreløpig ikke tildelt (U1, U2, U6). Hvis prøveopparbeidelse, NMR måling og spektrum behandling utføres som angitt i denne protokollen, er selv tilstrekkelig til å rutinemessig d spektral oppløsningetect delvis splitting av visse topper (PtdS, PtdE, PtdE plasm, AAPtdE; nederst til venstre). . Som en konsekvens, kvalitativ og kvantitativ analyse av ytterligere PL undergrupper kan tenkes i fremtiden figur 3, nederst til høyre, illustrerer kraften i judiciously valgte prosessparametere for å delvis separate signaler med lav-konsentrasjons forbindelser (her: PtdC1u, et PL avledet fra PTDC som ikke er fullstendig identifisert, og PTDC plasm) resonnere nær svært sterke signaler (her: PTDC).
Figur 3. Phospholipid 31 P NMR-spektroskopi (162 MHz) av hjernevev utdrag fra kvinnelige Lewis rotter. (Øverst til venstre panel) En ett-fase system (til venstre) ble foretrukket over en to-fasesystem (til høyre). Den vanlig brukte to-fasesystem vanskeliggjør riktigPL kvantifisering fordi mesteparten av den øvre fase er plassert utenfor det følsomme volumet av spolen. (Øverst til høyre panel) Komplett 31 P PL NMR-spektrum av rottehjerne. For bedre synlighet av svake signaler (PtdIP, PtdG), eksponentiell linjeutbredelse (LB = 3 Hz) ble brukt. I denne representasjonen, flere PL-signaler ikke er godt løst, særlig i de PTDC og PtdE regioner. For PL genererer mer enn en 31 P NMR signal, er observert kjerner understreket (P tdIP, PtdI P, P tdIP 2, PtdI P 2). Foreløpig ufordelte signaler er merket med "U n" (der n = 1, 2, ...). (Nederst til venstre panel) PtdE og PtdS regioner i samme spekteret. For bedre peak oppløsning, ble Lorentzian-Gaussian linje form transformasjon brukt (LB = -1 Hz, GB = 0,3). På grunn av disse prosessparametere, mange meget svake signaler PL er vanskelig å oppdage. Imidlertid, i det minste to topper kanskjelnes for hver PtdE, PtdE plasm, AAPtdE, og PtdS. (Nederst til høyre panel) PTDC regionen oppnådd med de samme prosessparametere som PtdE regionen. Flere signaler ved foten av den dominerende resonans PTDC ble påvist entydig, mens de ikke kan skilles i øvre spektrum generert med eksponensiell linjeutbredelse (AAPtdC, PTDC plasm, PtdC1u). Foruten den tiden tilordnet PTDC analog, PtdC1u, ytterligere mindre resonanser kan være til stede upfield fra PTDC. Forkortelser: PtdIP, phosphatidylinositol fosfat; PtdIP 2, phosphatidylinositol diphosphate; PTDA, fosfatidinsyre; PtdG, fosfatidylglycerol; CL, cardiolipin; PtdE .., summen av PtdE, PtdE plasm og AAPtdE; PtdI, phosphatidylinositol. For ytterligere forkortelser se legenden til figur 2. Gjengitt med tillatelse fra Lutz NW et al. (2010) Multiparametric optimalisering av 31 P NMR spektroskopiske analyser av phospholipiDS i råolje vevsekstrakter. 1. Kjemisk skift og signalseparasjon. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Høsting og Frysing Rat Brain | |||
| Dewar for N 2liq.; frysing klemme (f.eks hjemmelagde Wollenberger tang, refs 1 og 2, bunn av tabellen.); anestesi kammer; kirurgiske saks; skalpell; 500 ml flaske med rengjøring alkohol | 1 av hvert | ||
| Tang | 2 | ||
| 1 ml sprøyte, 10 ml sprøyte | 1 av hver per dyr | ||
| 25 g nåler | 2 per dyr | ||
| Eksempel FORBEREDELSERasjon | |||
| Typisk mengde hjernevev per utvinning | 250-350 mg | ||
| MeOH volum anvendes i homogenisere 250 - 350 mg hjernevev | 4 ml | ||
| 5 ml plastpipetten | 3 per ekstrakt | ||
| 10 ml plastpipetten | 1 per ekstrakt | ||
| Hetteglass (≥20 ml volum) | 1 per ekstrakt | ||
| Kloroform-resistente sentrifugerør | 1 per ekstrakt | ||
| Ventetid periode etter vev homogenisering i MeOH (blanding ved 4 ° C) | 15 min | ||
| Vann og CHCl 3 volum tilsatt til hjernevev homogenisert i 4 ml MeOH | 4 ml hver | ||
| Ventetid for etter blanding homogenisert vev med vann og CHCl 3 (blanding ved -20 ° C) | over natten | ||
| Sentrifugering for separasjon of vandig organisk ekstraktfase (glass sentrifugerør) | 13.000 x g, i 40 min ved 4 ° C. | ||
| Konsentrasjon av CDTA-løsning (vandig fase av oppløsningsmiddelblanding for å oppløse ekstraherte lipider) | 200 mm | ||
| pH i vandig fase av oppløsningsmiddelblanding for å oppløse ekstraherte lipider | 7.4 | ||
| Volumforhold i Lipidoppløsningsmiddelet En brukt for 31 P PL analyse (CDCl3: MeOH: CDTA løsning) | 5: 4: 1 | ||
| Mengde løsningsmiddel A brukes til å oppløse lipidene ekstrahert 250-350 mg hjernevev | 700 mL | ||
| Sentrifugering for å spinne ned faste partikler i prøven NMR (mikrosentrifugerør) | 11 000 xg, 30 min ved 4 ° C. | ||
| pH NMR prøve inneholdende vannløselige metabolitter | 7.3 | ||
| Prøvevolum overført til NMR rør, etter sentrifugeugation | 600 mL | ||
| MDP konsentrasjon i koaksial Sett spindel for 31 P NMR | 20 mm | ||
| NMR eksperimenter | |||
| Prøvetemperatur under NMR-eksperiment (for å bli justert for å minimalisere topp overlapping) | 25 ° C | ||
| Spinning frekvens under NMR eksperiment | 15-20 Hz | ||
| 1 H NMR Oppkjøps Parametere | |||
| Solvent gi 2 H lås signal | D-2 O | ||
| Eksitasjonspuls bredde, P1 | 11 usekunder | ||
| Eksitasjonspuls, forsterker demping, PL1 | 0 dB | ||
| FID størrelse, TD | 32 k | ||
| FID oppkjøpet time, AQ | 3,283 sek | ||
| Avslapping forsinkelse, D1 | 15 sek | ||
| Solvent undertrykkelse forsinkelse, D4 | 6 sek | ||
| Total repetisjon tid, TR | 24.3 sek | ||
| Spektral bredde i ppm, SWP | 12.47 ppm | ||
| Spektral bredde i Hz, SW | 4990 Hz | ||
| Mottaker gain, RG | 512 | ||
| Solvent undertrykkelse (kontinuerlig bølge) | CW | ||
| Solvent undertrykkelse, forsterker demping, PL9 | 50 dB | ||
| Antall transienter, NS | 32 eller 64 | ||
| 31 P NMR Oppkjøps Parametere | |||
| Solvent gi 2 H lås signal | CDCI3 | ||
| Eksitasjonspuls wiDTH, P1 | 9.5 usekunder | ||
| Eksitasjonspuls, forsterker demping, PL1 | 4 dB | ||
| FID størrelse, TD | 16 k | ||
| FID oppkjøpet tid, AQ | 2,019 sek | ||
| Avslapping forsinkelse, D1 | 15 sek | ||
| Total repetisjon tid, TR | 17 sek | ||
| Spektral bredde i ppm, SWP | 25 ppm | ||
| Spektral bredde i Hz, SW | 4058 Hz | ||
| Mottaker gain, RG (maksimum) | 16384 | ||
| Proton decoupling (kompositt puls decoupling) | CPD | ||
| Proton dekobling, forsterker demping, PL13 | 19 dB | ||
| Antall transienter, NS | 1500 eller 2000 | ||
| NMR Data Processing | 1 H Resolution Enhancement, Gaussian-Lorentzian Lineshape Transformation | ||
| Samlet vurdering av spekteret (hvis nødvendig, optimalisere separat for individuelle spektrale regioner, bruker 0.1 <GB <0,4, og -0,6 <LB <-0,2 Hz) | GB = 0,15, LB = -0,2 Hz | ||
| Meget svake signaler, f.eks, aromatiske syrer (alternativt apodization med LB ≥ 0,5 Hz) | GB = 0,015, LB = -0,3 Hz | ||
| Områder under topper: bruk lineshape passer for overlappende resonanser | |||
| 31 P-oppløsning ekstrautstyr, Gaussian-Lorentzian lineshape transformasjon | |||
| Samlet vurdering av spektrum (optimalisere separat for individuelle spektrale regioner, bruker 0,05 <GB <0,2, og -3,0 <LB <60; -1.0 Hz) | GB = 0,05, LB = -1.0 Hz | ||
| Meget svake signaler, f.eks PtdIP 2, PTDA: apodization | LB = 3 Hz | ||
| Områder under topper: bruk lineshape passer for overlappende resonanser | |||
| Referanser | |||
| 1. Palladino GW, Wood JJ, Proctor HJ. Forandringer fryse klemme teknikk for vev assay. The Journal of kirurgisk forskning 289, 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [En enkel teknikk for ekstremt hurtig innfrysing av store biter av vev]. Pflugers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Tabell 1. Eksperimentelle parametere for høy oppløsning 1 time og 31 P NMR-spektroskopi av hjernenvevsekstrakter. Typiske verdier for volum forhold og konsentrasjoner av løsningsmidler og reagenser som benyttes i hjernevev ekstraksjon og NMR-prøvepreparering, er presentert. Ytterligere anbefalte verdier er knyttet til prøve pH-verdi og måletemperaturen, så vel som NMR-og innhentingsprosessparametere. Mindre justeringer kan være nødvendig, særlig dersom protokollen blir brukt til andre formål enn hjernevevet. NMR parametere har blitt optimalisert for målinger på 9,4 T, og bør justeres etter behov for spektrometre som opererer på ulike magnetiske feltstyrker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMR-spektroskopi er en effektiv metode for å måle konsentrasjoner av kjemiske forbindelser i oppløsning i et meget reproduserbar og nøyaktig måte. Imidlertid, for å oppnå høy kvalitet av data er det nødvendig å overholde visse regler for prøvepreparering og analyse. Etter bestemmelse av metabolittkonsentrasjoner ved NMR-spektroskopi, hverken generering eller mottak av NMR-signalet dominerer kvantifisering feilen, dersom intensiteten av en observert signal nærmer deteksjonsterskel (spesielt svakt signal). I alle andre tilfeller biologisk variabilitet, en prøveprepareringsteknikk (ekstraksjonseffektivitet, fysisk og kjemisk stabilitet av forbindelser, pipettering og veiefeil etc.), og / eller valg av signalinnhentings og prosessparametere vil avgjøre presisjon og nøyaktighet av resultatene. Selvfølgelig vil noen metabolske endringer som skjer i løpet av vev innhøsting også gjenspeiles i metabolittkonsentrasjoner innhenteed. Derfor er det svært viktig å fullføre vev høste så fort som mulig, og å anvende bestemte vev frysing teknikker som trakt frysing om nøyaktig in vivo konsentrasjoner av raskt metabolizing forbindelser er viktig (spesielt glukose, laktat, ATP og dets catabolites, ADP og AMP).
Selv ved den mellomliggende magnetisk feltstyrke (9,4 T) på en rutinemessig høy oppløsning NMR spektrometer utmerket spektra kan oppnås. For eksempel, i 1H NMR-spektra av den vandige fase av rottehjerneekstrakter, signaler med en forskjell i kjemisk skift, Δδ, beløper seg til omtrent 0.005 ppm (tilsvarende 2,0 Hz ved 400 MHz resonansfrekvens) kan skjelnes og kvantifisert separat. Dette illustreres ved den delvise separering av (i) laktat og Treonin dubletter, og (ii) alanin dublett fra de små topper på basen sin (laktat 13 C satellitt dublett, figur 1,toppen). Spektrometer som opererer ved høyere felter (14.1 eller 18.8) T ville øke oppløsning og sensitivitet videre, selv om disse instrumentene er mindre vanlig hos NMR laboratorier på grunn av deres høye innkjøpskost.
Ved hjelp av en H NMR-spektroskopi, kan et bredt spekter av metabolitter analyseres samtidig, dvs. i ett enkelt oppkjøpet. Følsomheten av forsøket kan forbedres ved å øke antallet av akkumulerte transienter, selv om dette valget øker måletid proporsjonalt. (Signal-til-støy-forholdet er proporsjonalt med kvadratroten av antallet av transienter.) Imidlertid, den maksimale totale registreringstid gitt i ovennevnte protokoll (20 - 30 min) bør være tilstrekkelig for praktisk talt alle formål, med mindre mengde vev tilgjengelig for utvinning er svært begrenset. Foruten å gjøre bruk av de mest NMR-sensitive kjerne (proton), har metabolomic 1H NMR-spektroskopi fordelen av omfattendedatabaser blir tilgjengelig for ulike feltstyrker og prøve pH-verdier 10. Videre har programvare for automatisk eller halvautomatisk spektrum evaluering blir tilgjengelige 10.
Mens 1H NMR-spektra av vevsekstrakter kan godt løst uten tilsetning av chelateringsmidler, er dette ikke lenger er tilfelle for 31 P-NMR-spektra. Faktisk, er konsentrasjonen av det chelaterende middel som brukes (for eksempel EDTA eller CDTA) har en betydelig innflytelse på både linjebredde og kjemisk skift av 31 P NMR-signaler som stammer fra fosforylerte metabolitter. Økende CDTA konsentrasjon i et ekstrakt reduserer 31 P NMR linjebredder, men denne fordelen kan oppveies av mindre forskjeller mellom kjemiske skift, Δδ, i nabotopper. Derfor er mengden av chelaterende middel som brukes må være optimalisert for både linjebredde og kjemisk skift sammen. I lipid ekstrakter, disse to spektrale parametre er significantly påvirket av den totale prøvekonsentrasjon, det vil si mengden av ekstrahert vev, men også av pH-verdien og temperaturen av prøven i løpet av NMR-målingen. Følgelig må noen optimalisering av måleforholdene vurdere de kombinerte virkninger av alle eksperimentelle parametere som er involvert, og noen av disse ikke å være additive. Kompleksiteten av denne situasjonen er illustrert ved oppførselen PL 31 P NMR spektra er vist i figur 2. Selv om den laveste vevskonsentrasjon (118 mg / ml), den laveste temperatur (277 K), og den høyeste konsentrasjon CDTA (1,000 mM) testet vil resultere i laveste linjebredde, innstiller den foreslåtte protokoll bruk av moderat vev konsentrasjon (236 mg / ml), mellomprodukt CDTA konsentrasjon (200 mM) og romtemperatur (297 K) for å unngå signaloverlapping.
Selv om vilkårene for prøveopparbeidelse og spektrum oppkjøpet er av største betydning, detrollen spektrum prosesseringsparametre i å utvinne maksimalt informasjon fra de oppkjøpte rådata bør ikke undervurderes. Et spesielt sett av prosessparametere min være ideell for påvisning og kvantifisering av PL som oppstår ved lave konsentrasjoner; Imidlertid kan det samme settet av parametre skjule enkelte topper i "trangt" spektrale regioner (figur 3, øverst til høyre). Motsatt ville prosessparametere gir optimal oppløsning forbedring i regioner med sterkt overlappende resonanser (figur 3, nederst) gjengi lav intensitet topper umulig å oppdage. Siste utviklingen, herunder også en omfattende PL 31 P NMR database 13,14, i stor grad forenkle analysen av NMR spektra 13,14.
Til syvende og sist, må målene i den underliggende søknaden definere kriteriene for optimalisering, det vil si den ønskede balansen av spektral oppløsning, følsomhet, presisjon av metabolitt quantification, hastighet og andre faktorer. For eksempel er den anbefalte en-fase-system for PL analyse tillater mer pålitelig og effektiv PL kvantifisering enn to-fase systemer (figur 3, øverst til venstre), og gir høy spektral oppløsning, så vel som tilstrekkelig følsomhet for kvantifisering av mindre rikelig PL . Imidlertid, i tilfeller hvor det er best signalseparasjon er av mye høyere prioritet enn effektiv og presis kvantifisering, bruk av en høyere prosentandel av kloroform-d i oppløsningsmiddelblandingen kan bli forsøkt, selv om dette lett fører til at faseatskillelse i prøven. Hvis dette er tilfelle, må volumet av den nedre fase bli bestemt for å oppnå absolutte PL mengder (mg PL, pr g vev eller mg totalprotein).
I proton-dekoblet heteronukleære NMR eksperimenter, kan signal-intensiteter endres ved nukleære Overhauser effekt (NOE), i tillegg til metning som skyldes hurtige innhentingsordninger. Dersom ikke-korrigert disse effektene resulterer i metabolitt quantitation feil. Det er to alternative strategier for å håndtere denne utfordringen. I den første metode, blir individuelle transienter gi kjøps adskilt av lange forsinkelser. Denne metoden unngår metning eller NOE men resulterer i relativt lange eksperimenter; Det bør brukes hvis presise og nøyaktige resultater er nødvendig. I noen tilfeller kan ha prioritet som skal gis til hurtig spektrum anskaffelse, særlig for meget fortynnede prøver som kun kan måles ved hjelp av et høyt antall av transienter. I slike tilfeller ville tillegg av paramagnetiske avslapping agenter til prøven tillate rask datainnsamling uten metning eller NOE. Alternativt kan fast datainnsamling uten tilsetning av paramagnetiske midler anvendes. Den sistnevnte metoden krever korreksjon av signalområder ved hjelp av korreksjonsfaktorer som må bestemmes for hver NMR-resonans, mens tilstedeværelsen av avspenningsmidler forårsaker noen utvidelse av NMR-signaler som kan redusere presisjonen av metabolitten for kvantifiseringfylt spektrale regioner. Vanligvis er det optimale valg av eksperimentelle betingelser, ikke bare diktert av prøvetype, men også av informasjonen som skal ekstraheres fra et eksperiment 13. Hvis høy prioritet må gis til hurtig analyse av ganske rikelig metabolitter, uten behov for høy presisjon og nøyaktighet, kan det være tilstrekkelig å måle svært konsentrerte prøver og anvende korte repetisjonstider, eventuelt med paramagnetiske avslapningsmiddel tilsettes til prøven. I motsetning til dette, dersom nøyaktig kvantifisering av et stort antall av metabolitter er viktigere enn hastighet, er det å foretrekke å bruke mindre konsentrerte ekstrakter og aksepterer lange NMR-innhentingstider, som demonstrert av protokollen spesifisert her. Videre, hvis et bestemt forskningsprosjekt streker spesifikke metabolitter, forsøksbetingelsene kan reguleres for å oppnå optimal spektral oppløsning for de spektrale områder det gjelder. Protokollen og diskusjon presenteres her kan fungere som en guide for optimization av metabolomic analyse av råolje vevsekstrakter ved NMR-spektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E.
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
