Optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw

Summary

Cochleair implantaat (CI) in staat stellen het horen door directe elektrische stimulatie van de gehoorzenuw. Echter, slechte frequentie en intensiteit resolutie beperkt de kwaliteit van het gehoor met CI. Hier beschrijven we optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw in muizen als een alternatieve strategie voor auditieve research en ontwikkeling van toekomstige CI's.

Abstract

Directe elektrische stimulatie van de spiraal ganglion neuronen (Sgns) door cochleair implantaat (CI) kan geopend spraakverstaan ​​in het merendeel van de geïmplanteerde dove proefpersonen ^1-6. Niettemin geluidsverwerkingsalgoritme met huidige CI heeft slechte frequentie en intensiteit resolutie door brede stroomspreiding van elk contact elektrode activeren een groot aantal Sgns langs de tonotopische as van het slakkenhuis ^7-9. Optische stimulatie wordt voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie die ruimtelijk meer belooft beperkt activatie van Sgns en derhalve hogere frequentieresolutie codering. De laatste jaren heeft directe infrarood verlichting van de cochlea gebruikt om reacties oproepen bij de gehoorzenuw ^10. Toch vereist het hogere energieën dan elektrische stimulatie ^10,11 en de onzekerheid blijft bestaan ​​over het onderliggende mechanisme ^12. Hier wordt een methode op basis van optogenetics om Sgns stimuleren beschrijven wemet een lage intensiteit blauw licht, met behulp van transgene muizen met neuronale expressie van channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ of-virus gemedieerde expressie van de ChR2-variant Catch ^14. We gebruikten micro-light emitting diodes (μLEDs) en vezel gekoppeld lasers om ChR2 expressie Sgns stimuleren door middel van een kleine kunstmatige opening (cochleostomie) of het ronde venster. We getest de reacties van hoofdhuid opnames van licht-evoked potentials (optogenetische auditieve hersenstam respons: oABR) of door micro-elektrode opnames van de auditieve route en vergeleken hen met akoestische en elektrische stimulatie.

Introduction

Volgens de World Health Organization, 360 miljoen mensen wereldwijd lijden aan gehoorverlies. In dove proefpersonen, directe elektrische stimulatie van Sgns door CIS staat geopend spraakverstaan ​​in de meerderheid van hen ^1,2,4,5. Ook al CI geïmplanteerd bij meer dan 200.000 mensen, dus de meest succesvolle neuroprothese, geluid codering gedreven door de huidige cochleaire implantaten is beperkt. CI's door elektrische stimulatie een aantal elektrodes waar iedereen activeert een tonotopische gebied van de gehoorzenuw aldus de disfunctionele sensorische orgaan van Corti omzeilen in de cochlea. Normaal horende luisteraars kunnen discrimineren meer dan 2000 frequenties, maar de huidige CI's gebruiken slechts tot 12-22 frequentie kanalen ^4. Dit komt door wijdverspreide stroom uit elke prikkelelektrode ^7,9 activering van een groot aantal Sgns dat vele verschillende geluidsfrequenties ^8,15 vertegenwoordigen. Dezebeperking kan worden verbeterd met behulp van multipolaire stimulatie, maar ten koste van hogere stroomverbruik ^16,17. Hun output dynamisch bereik voor geluid intensiteit is ook beperkt, meestal onder de 6-20 dB ^4,18. Om deze redenen, het verbeteren van de frequentie en intensiteit resolutie zijn belangrijke doelstellingen voor het verhogen van CI prestaties om spraakherkenning te verbeteren in rumoerige omgevingen, prosodie begrip en muziekbeleving.

Een andere optie om de gehoorzenuw stimuleren is optische stimulatie. Licht kan gemakkelijk worden gericht op een kleine populatie SGN target veelbelovende betere ruimtelijke opsluiting toenemende frequentie resolutie en ook groter dynamisch bereik, wat resulteert in een betere resolutie intensiteit. Inderdaad, cochleaire stimulering met infrarood licht heeft uitstekende frequentieresolutie in diermodellen ^10,11,19. Een nadeel van dergelijke stimulatie is dat het hogere energieën dan elektrische stimulatie vereist <sup> 10,11. Bovendien zijn zorgen over het vermogen van de methode om direct te stimuleren auditieve neuronen geuit ^12,20.

Als alternatief voor infrarode stimulatie, in dienst nemen we optogenetics te renderen Sgns licht gevoelig. Optogenetics is een nieuwe benadering die genetische en optische technieken combineert non-invasively en specifiek controle cellen met hoge temporele precisie (reviews ^{21 en 23).} De momenteel meest gebruikte modaliteit stelt de expressie van microbiële channelrhodopsin 2 (ChR2) gen van Chlamydomonas reinhardtii en varianten daarvan, coderend voor een lichte-gated kation kanaal ^24. ChR2 is een 7-transmembraan-helix eiwit dat bij getransduceerd tot neuronen en geactiveerd door blauw licht, fungeert als niet-selectief kation-kanaal, waardoor depolariseren de cellen ^24-27. ChR2 is goed gekarakteriseerd ^{24,28- 31} en veel varianten ontwikkeld om actio wijzigenn spectrum, poorten en permeabiliteitseigenschappen ^32,33. Het doel van ons werk is cochleair optogenetics stellen voor de activering van de gehoorbaan. We merken dat de optogenetic benadering van de gehoorzenuw stimuleren vereist genetische manipulatie van de ganglion spirale voor de expressie van channelrhodopsin. Werken met muizen en ratten maakt het gebruik van beschikbare transgene dieren ^13,34,35, die expressie van channelrhodopsin bieden weinig variabiliteit langs de tonotopische as en in dieren ^36. De combinatie van voorwaardelijke allelen ³⁷ met de juiste Cre-lijnen zorgt voor cel-specifieke expressie. Genoverdracht in de ganglion spirale andere dieren het gebruik van virussen zoals adeno-geassocieerd virus dat een standaard aanpak optogenetics ³⁸ en dat we bleek goed in muizen ^36. Genetische manipulatie en expressie van transgenen coderend buitenaardse eiwitten beer risico op bijwerkingen zoals immune reacties en / of proliferatie, gecompromitteerde toestand of zelfs de dood van de genetisch gemanipuleerde cellen. Ten behoeve van deze demonstratie gebruiken we transgene muizen die ChR2 in ganglion spirale neuronen onder Thy-1 promotor ¹³ optisch stimuleren gehoorbaan. We merken dat andere channelrhodopsin varianten kunnen worden gebruikt voor hetzelfde doel als we aangetoond met virus-bemiddelde overdracht van de variant val ¹⁴ in Sgns ^39.

Terwijl cochleair optogenetics vereist genetische manipulatie, het biedt moleculaire afstelling voor optimale SGN stimulatie en beloften verbeterde frequentie en intensiteit resolutie in vergelijking met elektrische stimulatie. Optogenetische stimulatie van de auditieve route is zeer relevant voor het horen van het onderzoek. Zo belooft vooruitgang in studies van de activiteit-afhankelijke verfijning van tonotopy tijdens de ontwikkeling, in de analyse van de vereiste spectrale integratie geluid localization en de mate van interactie tussen frequentiespecifieke afferente projecties in het centrale auditieve systeem.

Protocol

Alle experimenten die in dit werk werden uitgevoerd met de ethische normen gedefinieerd door de Duitse wet betreffende de bescherming van proefdieren. De universiteit van Göttingen raad voor dierenwelzijn en het welzijn van dieren kantoor van de deelstaat Nedersaksen ingestemd met de experimenten. 1 Voorbereiding van μLED-stimulator Voor μLEDs, eerst de μLED-stimulator te bereiden. Gebruik blauwe LED's met 200 van 200 micrometer actieve oppervlak (μLED, zie Materialen tab…

Representative Results

Een optimale cochleostomie kritisch en verhoogt de kans op een succesvolle experiment. Hierdoor Venster regelmatig is klein, en er is geen schade van de interne cochleaire structuren. Bijvoorbeeld, bloeden geeft beschadiging van de stria vascularis. Een goed voorbeeld is weergegeven in figuur 1B. Met behulp ChR2-transgene muizen, wordt ChR2 uitgedrukt in de Sgns binnen het slakkenhuis (figuur 1C). Blauw licht verlichting, hetzij door ?…

Discussion

De beschreven experimenten tonen het optogenetic stimulatie van de Sgns en kan in principe ook worden gebruikt om binnenste en / of buitenste haarcellen te stimuleren, mits de expressie van opsins. Deze experimenten vereisen veel geduld en zorg. Zoals eerder vermeld, de meest kritische stappen is een goede cochleostomie / ronde venster insertie en een geschikte positie en oriëntatie van de lichtbron.

Er zijn beperkingen met optogenetische stimulatie bij gebruik ChR2. In ons geval oABR ampli…

Materials

Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe