Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Summary

Los implantes cocleares (IC) permitir la audición por la estimulación eléctrica directa del nervio auditivo. Sin embargo, la mala frecuencia y la intensidad de la resolución limita la calidad de la audición con entidades de crédito. Aquí se describe la estimulación optogenética del nervio auditivo en ratones como estrategia alternativa para la investigación auditiva y el desarrollo de las futuras entidades de crédito.

Abstract

La estimulación eléctrica directa de las neuronas del ganglio espiral (NEG) por implantes cocleares (IC) permite la comprensión del habla abierto en la mayoría de los sujetos sordos implantados ^1-6. No obstante, la codificación de sonido con IC actuales tiene mala frecuencia y la resolución de intensidad debido a la amplia difusión actual de cada contacto de electrodo activación de un gran número de NEG lo largo del eje tonotópica de la cóclea ^{7 9.} Estimulación óptico se propone como una alternativa a la estimulación eléctrica que promete más espacialmente confinada activación de NEG y, por tanto, una mayor resolución de frecuencia de la codificación. En los últimos años, la iluminación de infrarrojos directa de la cóclea se ha utilizado para evocar respuestas en el nervio auditivo ^10. Sin embargo se requiere de altas energías que la estimulación eléctrica ^10,11 y la incertidumbre se mantiene en cuanto al mecanismo subyacente ^12. Aquí se describe un método basado en la optogenética para estimular NEGcon la luz azul de baja intensidad, el uso de ratones transgénicos con expresión neuronal de canalrodopsina 2 (ChR2) ¹³ o la expresión mediada por virus de la ChR2 variante Catch ^14. Utilizamos micro-diodos emisores de luz (μLEDs) y láseres de fibra acoplada para estimular NEG ChR2 expresan a través de una pequeña abertura artificial (cocleostomía) o la ventana redonda. Analizamos las respuestas por las grabaciones del cuero cabelludo de los potenciales evocados (luz optogenética de respuesta auditiva del tronco cerebral: oABR) o mediante grabaciones de microelectrodos de la vía auditiva y los comparamos con la estimulación acústica y eléctrica.

Introduction

Según la Organización Mundial de la Salud, 360 millones de personas en todo el mundo sufren de pérdida de la audición. En los sujetos sordos, la estimulación eléctrica directa de NEG por IC, permite la comprensión del habla abierta en la mayoría de ellos ^1,2,4,5. A pesar de que las entidades de crédito han sido implantadas en más de 200.000 personas, siendo así la neuroprótesis más exitoso, codificación de sonido conducido por los actuales implantes cocleares es limitado. IC se basan en la estimulación eléctrica por un cierto número de electrodos donde cada uno se activa una región tonotópico del nervio auditivo evitando así el órgano sensorial disfuncional de Corti en la cóclea. Oyentes con audición normal pueden discriminar más de 2000 frecuencias, sin embargo los IC de hoy utilizan sólo hasta 12-22 canales de frecuencia ^4. Esto es debido al flujo de corriente generalizada de cada electrodo de estimulación ^7,9, la activación de un gran número de NEG que representan muchas diferentes frecuencias de sonido ^8,15. Estelimitación se puede mejorar utilizando la estimulación multipolar pero a costa de un mayor consumo de potencia ^16,17. Su salida de rango dinámico para la intensidad del sonido también es limitado, por lo general por debajo de 6-20 dB ^4,18. Por estas razones, la mejora de la frecuencia y la intensidad de la resolución son objetivos importantes para aumentar el rendimiento del IC para mejorar el reconocimiento de voz en entornos ruidosos, comprensión de la prosodia y la percepción musical.

Una opción diferente para estimular el nervio auditivo es la estimulación óptica. La luz puede ser convenientemente centrado para apuntar a una pequeña población SGN, prometiendo mejor confinamiento espacial, el aumento de resolución de frecuencia y también ampliar el rango dinámico, lo que resulta en una mejor resolución intensidad. De hecho, la estimulación coclear con luz infrarroja ha demostrado una excelente resolución de frecuencia en modelos animales ^10,11,19. Una desventaja de este tipo de estimulación es que requiere energías más altas que la estimulación eléctrica <sup> 10,11. Por otra parte, las preocupaciones sobre la capacidad del método para estimular directamente las neuronas auditivas se han planteado ^12,20.

Como alternativa a la estimulación infrarroja, empleamos la optogenética para hacer NEG sensible a la luz. Optogenética es un nuevo enfoque que combina técnicas genéticas y ópticas de manera no invasiva y controlar específicamente las células con alta precisión temporal (opiniones ^{del 21 al 23).} La modalidad actualmente más frecuentemente utilizado emplea la expresión del gen microbiana canalrodopsina 2 (ChR2) de Chlamydomonas reinhardtii y variantes de la misma, que codifica un canal de cationes de luz cerrada ^24. ChR2 es una proteína transmembrana-7-hélice que, cuando se transduce en neuronas y activado por la luz azul, actúa como canal de cationes no selectivo, por lo tanto las células despolarizante ^{de 24 27.} ChR2 ha sido bien caracterizado ^{24,28- 31} y muchas variantes se han desarrollado para modificar action del espectro, de compuerta y permeabilidad propiedades ^32,33. El objetivo de nuestro trabajo es establecer la optogenética coclear para la activación de la vía auditiva. Tomamos nota de que el enfoque optogenética para estimular el nervio auditivo requiere manipulación genética del ganglio espiral para la expresión de canalrodopsina. Trabajando con ratones y ratas permite el uso de animales transgénicos disponibles ^13,34,35, que proporcionan la expresión de canalrodopsina con poca variabilidad a lo largo del eje tonotópico y animales a través de ^36. Combinando alelos condicionales ³⁷ con Cre-líneas apropiadas proporciona la expresión específica de la célula. La transferencia de genes en el ganglio espiral de otros animales requiere el uso de virus tales como el virus adeno-asociado que es un enfoque estándar en optogenética ³⁸ y que hemos demostrado que funciona bien en ratones ^36. La manipulación y la expresión de transgenes que codifican proteínas exóticas oso riesgos de efectos adversos tales como IMMU genéticarespuestas y / o proliferación ne, estado comprometido o incluso la muerte de las células manipuladas genéticamente. Para el propósito de esta demostración usamos ratones transgénicos que expresan ChR2 en las neuronas del ganglio espiral bajo el promotor Thy-1 ¹³ para estimular ópticamente la vía auditiva. Observamos que otras variantes canalrodopsina se pueden utilizar para el mismo propósito que hemos demostrado utilizando la transferencia mediada por virus de la variante de captura ¹⁴ en NEG ^39.

Mientras que la optogenética coclear requiere la manipulación genética, ofrece tuning molecular para optimizar la estimulación SGN y promesas mejoró la frecuencia y la intensidad de la resolución en comparación con la estimulación eléctrica. Estimulación optogenética de la vía auditiva es muy relevante para la investigación de la audición. Por ejemplo, promete avances en los estudios de la refinamiento dependiente de la actividad de tonotopia durante el desarrollo, en el análisis de los requisitos de integración espectral en localizat sonidode iones y de la extensión de la interacción entre las proyecciones aferentes frecuencia específica en el sistema auditivo central.

Protocol

Todos los experimentos presentados en este trabajo se llevaron a cabo con los estándares éticos definidos por la ley alemana de protección de los animales de experimentación. La junta de la Universidad de Goettingen para el bienestar animal y la oficina de bienestar animal del estado de Baja Sajonia aprobaron los experimentos. 1 Preparación de μLED-estimulador Para μLEDs, primero preparar el estimulador μLED. Utilizar LEDs azules con 200 por 200 m de superficie activa (μL…

Representative Results

Un cocleostomía óptima es crítica y aumenta la probabilidad de un experimento exitoso. Esto significa que la ventana es regular, pequeña, y no hay ninguna lesión de las estructuras internas cocleares. Por ejemplo, sangrado indica daño de la estría vascular. Un buen ejemplo se presenta en la Figura 1B. Utilizando ratones transgénicos ChR2, ChR2 se expresa en las NEG dentro de la cóclea (Figura 1C). Azul de luz de iluminación, …

Discussion

Los experimentos descritos demuestran la estimulación optogenética de las NEG, y pueden, en principio, también pueden utilizarse para estimular las células ciliadas internas y / o externas, siempre que la expresión de opsinas. Estos experimentos requieren mucha paciencia y cuidado. Como se ha mencionado antes, los pasos más críticos son una buena cocleostomía inserción / ventana redonda, así como una posición adecuada y la orientación de la fuente de luz.

Existen limitaciones con…

Materials

Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe