聴覚神経の光遺伝学的刺激
Summary
人工内耳（CIの）聴神経を直接電気刺激によって聴力ができます。しかし、貧しい頻度と強度分解能はCIので聴力の質を制限します。ここでは、聴覚の研究と今後のCIを開発するための代替戦略として、マウスにおいて聴覚神経の光遺伝学的刺激を説明します。
Abstract
人工内耳によるらせん神経節ニューロン（SGNS）の直接電気刺激（CIS）は、移植された聴覚障害の被験者1〜6の大部分においてオープンスピーチ理解を可能にします。それにもかかわらず、現在のCIとの健全なコーディングが原因蝸牛7 9のtonotopic軸に沿ってSGNSの多数を作動させる各電極接点から幅広い現在の普及に貧しい頻度と強度分解能を有する。光刺激は、したがってSGNSと、空間的により閉じ込められた活性化、符号化のより高い周波数分解能を約束する電気刺激の代替として提案されている。近年では、蝸牛の直接の赤外線照明は聴神経10における応答を誘発するために用いられてきた。それにもかかわらず、電気刺激10,11と不確実性は、基礎となる機構12のように残っているよりも高いエネルギーを必要とします。ここでは、SGNSを刺激するためにoptogeneticsに基づく方法を記載している低強度の青色光と、ChR2を変キャッチ14のチャネルロドプシン2（ChR2を）13またはウイルス媒介発現が神経細胞の発現とトランスジェニックマウスを用いて。私たちは、小さな人工開口部（蝸牛）または丸い窓からChR2を発現SGNSを刺激するために、マイクロ発光ダイオード（μLEDs）とファイバ結合レーザを使用。聴覚路または微小電極記録によって音響および電気刺激と比較した：私たちは、光誘発電位（oABR光遺伝学的聴性脳幹反応）の頭皮記録によって反応を分析した。
Introduction
世界保健機関（WHO）によると360万人が世界中で難聴に悩まされている。聴覚障害の被験者では、CIのよるSGNSの直接電気刺激はそれら1,2,4,5の大部分においてオープンスピーチ理解を可能にする。 CIは、したがって最も成功しneuroprosthesisいる、20万人以上の人に移植されているにもかかわらず、現在の蝸牛インプラントによって駆動音エンコードが限られている。 CIは、各1は、このように蝸牛内コルチ機能不全感覚器官を迂回する聴覚神経のtonotopic地域を活性化し、電極の特定の数によって電気刺激に基づいています。通常の聴力リスナーが2,000以上の周波数を識別することができる、しかし、今日のCIのは、12〜22の周波数チャネル4まで使用しています。これは8,15、多くの異なるサウンド周波数を表すSGNSの多数を作動させる、各刺激電極7,9から広まっ電流の流れに起因している。この制限は、多極刺激を使用して、より高い電力消費16,17を犠牲にして改善することができる。音の強さのための彼らの出力ダイナミック·レンジは、通常、dBで4,18 6-20の下にも制限されています。これらの理由から、頻度および強度の解像度を向上させることは、ノイズの多い環境、韻律理解や音楽の知覚に音声認識を改善するためにCI性能を高めるための重要な目的である。
聴覚神経を刺激する別のオプションは、光刺激である。光は、好都合には、良好な空間閉じ込め有望な周波数分解能を増加させ、より良い強度分解能で、その結果、ダイナミックレンジを広げる、SGN小集団を標的とするように集束させることができる。実際には、赤外光による蝸牛刺激は、動物モデル10,11,19に優れた周波数分解能を示している。刺激のこの種の1つの欠点は、電気刺激よりも高いエネルギーを必要とすることで<suP> 10,11。また、直接聴覚神経細胞を刺激する方法の能力についての懸念が12,20が提起されている。
赤外線刺激の代わりに、私たちはSGNS光感受性レンダリングするoptogeneticsを採用している。 Optogeneticsは、非侵襲的に遺伝的および光学技術を組み合わせて、具体的には、高い時間精度（レビュー21〜23）で細胞を制御する新規のアプローチである。現在最も頻繁に使用される様式は、 クラミドモナスの微生物チャネルロドプシン-2（ChR2を）遺伝子の発現を採用し、光依存性カチオンチャネル24をコードするその変異体である。 ChR2を、ニューロンに形質導入し、青色光によって活性化されると、このように細胞の24 27を脱分極、非選択的陽イオンチャネルとして機能し、7回膜貫通ヘリックスタンパク質である。 ChR2を、よく特徴付けられている24,28- 31と多くの変異体は、アクティオを変更するために開発されているn個のスペクトル、ゲーティングと透磁率の特性32,33。私たちの仕事の目的は、聴覚経路の活性化のための蝸牛optogeneticsを確立することである。私たちは、聴覚神経を刺激する光遺伝学的アプローチは、チャネルロドプシンを発現させるためのスパイラル神経節の遺伝子操作を必要とすることに注意してください。マウスおよびラットの操作tonotopic軸に沿っや動物36のところが少し変動してチャネルロドプシンの発現を提供利用可能なトランスジェニック動物13,34,35、の使用を可能にする。適切なのCre-ラインとの条件付き対立遺伝子37を組み合わせることにより、細胞特異的発現を提供する。他の動物の螺旋神経節への遺伝子導入は、そのようなoptogenetics 38に標準的なアプローチであると私たちはマウス36でうまく動作することを示したアデノ随伴ウイルスなどのウイルスを使用する必要があります。外国人のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子操作および発現は、IMMUなどの副作用のリスクを負担するNE応答および/または増殖、妥協の条件または遺伝的に操作された細胞の死。このデモの目的のために、私たちは、光学的、聴覚経路を刺激するのThy-1プロモーター13歳未満のらせん神経節ニューロンにおいてChR2を発現するトランスジェニックマウスを使用しています。私たちは、SGNS 39に変異体キャッチ14のウイルス媒介転移を用いて実証されるように、他のチャネルロドプシン変異体は、同じ目的に使用することができることに留意されたい。
蝸牛optogeneticsは、遺伝子操作を必要とするが、それは最適化されたSGN刺激と電気刺激と比較すると、周波数や強度分解能を向上させ、約束のための分子チューニングを提供しています。聴覚路の光遺伝学的刺激が研究を聞くために非常に関連しています。たとえば、音のスペクトルの統合のための要件の分析に、開発中のtonotopyの活性依存洗練の研究の進歩を約束localizatイオンおよび中枢聴覚システムにおける周波数固有の求心性突起間の相互作用の程度。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された実験は、SGNSの光遺伝学的刺激を実証し、そして、原則的に、また内側及び/又は外側有毛細胞を刺激するために使用することができ、オプシンの発現を提供した。これらの実験は、多くの忍耐と注意が必要です。前述のように、最も重要なステップは、光源の良好な蝸牛/正円窓挿入ならびに適切な位置および向きである。
ChR2をを使用して、光遺伝学的刺激に…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、教育研究（NeurotechnologyためのバーンスタインフォーカスT.モーザーに、01GQ0810を付与し、MED-ELドイツ）ドイツ連邦省によってサポートされていました。脳のナノスケール顕微鏡および分子生理学のためのセンターでドイツ研究財団（FZT 103、T.モーザー）とSFB889を通して、）N. Strenzke及びT.モーザーする。
Materials
| Urethane | Sigma Aldrich | U2500-100G | Anesthetic |
| Xylazine HCl | RXV | Sedative and analgesic | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser | Analgesic | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Only to be used to hold soft tissue |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | To open the skin and help with the muscle dissection |
| Lempert Rongeurs | Fine Science Tools | 16004-16 | They are very useful to easily remove the bone from the bulla |
| 473-nm laser | Changchun New Industries | MLL-III473 | 100 mW solid state 473 nm laser |
| Laser driver | Changchun New Industries | DPSSL MLL 100 mW | TTL operated laser driver |
| 250 µm optical fiber | Any comercial ; e.g. Thorlabs | M42L05 | |
| Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | PCAOM VIS | Control the amount of light coupled into the fiber from the laser |
| Controller for Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | 160T1-8SAR-24-0.8 | Control the acousto-optic modulator |
| Solo2 laser power & energy meter | Gentec-EO | Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser | |
| Blue µLED | Cree | C470UT200 | It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough |
| TDT System | Tucker-Davis Technologies | RZ6-A-P1 | It can be used any system for stimulus generation presentation and data acquisition |
| Single-shank, 16-channel silicon probe | Neuronexus | a1x16-5mm-100-177-CM16LP | These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use |
| Omnidrill | World Precision Instruments | 503598 | Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation |
| Micro Drill Steel Burrs | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Self tapping bone screw | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19010-10 | Reference screw |
| Micromanipulator | any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis | Positioning of recording probe |
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