Stimulation optogenetic du nerf auditif

Summary

Les implants cochléaires (IC) de permettre l'audition par la stimulation électrique directe du nerf auditif. Cependant, la mauvaise fréquence et la résolution d'intensité limite la qualité de l'audience avec les IC. Nous décrivons ici la stimulation optogenetic du nerf auditif chez la souris comme une stratégie alternative pour la recherche et le développement auditif futurs IC.

Abstract

Stimulation électrique directe des neurones du ganglion spiral (de Sgns) par les implants cochléaires (IC) permet ouvert compréhension de la parole dans la majorité des sujets sourds implantés ^1-6. Néanmoins, le codage du son avec IC actuelles a une mauvaise fréquence et la résolution d'intensité due à large propagation actuelle de chaque contact de l'électrode activation d'un grand nombre de Sgns long de l'axe de la cochlée tonotopique ^{7 9.} Stimulation optique est proposé comme une alternative à la stimulation électrique spatialement plus que les promesses activation de Sgns limite et, par conséquent, une meilleure résolution en fréquence du codage. Au cours des dernières années, l'illumination infrarouge directe de la cochlée a été utilisée pour provoquer des réponses dans le nerf auditif ^10. Néanmoins, il nécessite des énergies supérieures à la stimulation électrique ^10,11 et l'incertitude demeure sur le mécanisme sous-jacent ^12. Ici, nous décrivons une méthode basée sur optogénétique pour stimuler Sgnsavec la lumière bleue de faible intensité, utilisant des souris transgéniques avec expression neuronale de channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ ou expression du virus médiation de la ChR2 variante Catch ^14. Nous avons utilisé des diodes électroluminescentes (μLEDs) et des lasers à fibre couplé à stimuler Sgns CHR2-exprimant à travers une petite ouverture artificielle (cochléostomie) ou de la fenêtre ronde micro-lumière. Nous avons mesuré les réponses par des enregistrements du cuir chevelu de potentiels évoqués lumière (optogenetic réponse du tronc cérébral: oABR) ou par des enregistrements de microélectrodes de la voie auditive et les avons comparés avec une stimulation acoustique et électrique.

Introduction

Selon l'Organisation mondiale de la santé, 360 millions de personnes dans le monde souffrent de déficience auditive. Chez les sujets sourds, la stimulation électrique directe de Sgns par IC permettre ouvert compréhension de la parole dans la majorité d'entre eux ^1,2,4,5. Même si les IC ont été implantés dans plus de 200.000 personnes, étant ainsi le neuroprosthesis plus de succès, le codage de son entraînée par les implants cochléaires actuels est limitée. IC sont basés sur la stimulation électrique par un certain nombre d'électrodes, où chacune une région active un tonotopique du nerf auditif contournant ainsi l'organe de Corti dysfonctionnement sensoriel dans la cochlée. Auditeurs normo-entendants peuvent distinguer plus de 2000 fréquences, mais les IC d'aujourd'hui utilisent seulement jusqu'à 12-22 canaux de fréquence ^4. Cela est dû à la circulation du courant de chaque électrode généralisée stimulant ^7,9, l'activation d'un grand nombre de Sgns qui représentent ^8,15 nombreuses fréquences sonores différentes. Celimitation peut être améliorée en utilisant une stimulation multipolaire mais au détriment de la consommation d'énergie supérieure ^16,17. Leur dynamique de sortie de l'intensité sonore est également limitée, généralement inférieure à 6-20 dB ^4,18. Pour ces raisons, l'amélioration de la fréquence et la résolution d'intensité sont des objectifs importants pour augmenter les performances du CI pour améliorer la reconnaissance vocale dans des environnements bruyants, la compréhension et la prosodie perception de la musique.

Une option différente pour stimuler le nerf auditif est la stimulation optique. La lumière peut être facilement porté à cibler une petite population de SGN, promettant un meilleur confinement spatial, augmentant la résolution de fréquence et également d'élargir la plage dynamique, résultant en une meilleure résolution d'intensité. En effet, la stimulation cochléaire avec de la lumière infrarouge a montré une excellente résolution de fréquence dans des modèles animaux ^10,11,19. Un inconvénient de ce type de stimulation est qu'il nécessite des énergies plus élevées que la stimulation électrique <sup> 10,11. En outre, les préoccupations quant à la capacité de la méthode à stimuler directement les neurones auditifs ont été soulevées ^12,20.

Comme une alternative à la stimulation infrarouge, nous employons optogénétique rendre Sgns sensible à la lumière. Optogenetics est une nouvelle approche qui combine les techniques génétiques et optiques non-invasive et de contrôler spécifiquement les cellules avec une grande précision temporelle (Avis ^{21 au 23).} La modalité actuellement la plus fréquemment utilisée emploie l'expression microbienne de la 2 channelrhodopsin (CHR2) gène de Chlamydomonas reinhardtii et des variantes de ceux-ci, codant pour un canal de cation déclenché par la lumière ^24. CHR2 est une protéine à 7 domaines transmembranaires en hélice qui, lorsque transduit dans des neurones et activée par la lumière bleue, agit en tant que canal cationique non sélectif, dépolarisant ainsi les cellules ^{24 27.} ChR2 a été bien caractérisé ^{24,28- 31} et de nombreuses variantes ont été développées pour modifier l'action spectre, déclenchement et de perméabilité ^32,33. Le but de notre travail est d'établir optogénétique cochléaire pour l'activation de la voie auditive. Nous notons que l'approche optogenetic pour stimuler le nerf auditif nécessite une manipulation génétique du ganglion spiral pour l'expression de channelrhodopsin. Utilisation de la souris et le rat permet l'utilisation d'animaux transgéniques ^13,34,35 disponibles, qui fournissent l'expression d'channelrhodopsin avec peu de variabilité le long de l'axe et à travers tonotopique ³⁶ animaux. La combinaison des allèles conditionnels ³⁷ avec Cre-lignes appropriées permet l'expression spécifique des cellules. Le transfert de gènes dans le ganglion spiral d'autres animaux nécessite l'utilisation de virus tels que le virus adéno-associé qui est une approche standard dans optogénétique ³⁸ et que nous avons montré de bons résultats chez la souris ^36. La manipulation génétique et l'expression de transgènes codant pour des protéines étrangères risques baissiers pour les effets indésirables tels que la vacnir des réponses et / ou la prolifération, la situation compromise, voire la mort de cellules génétiquement manipulées. Pour les besoins de la démonstration, nous utilisons des souris transgéniques exprimant CHR2 dans les neurones du ganglion spiral dans le cadre du promoteur Thy-1 de ¹³ à stimuler optiquement la voie auditive. Nous notons que d'autres variantes de channelrhodopsin peuvent être utilisés pour le même but que nous avons démontré en utilisant le transfert de virus médiation de la variante Catch ¹⁴ en Sgns ^39.

Alors que l'optogénétique cochléaire nécessite une manipulation génétique, il offre tuning moléculaire pour optimiser la stimulation SGN et promesses améliorée fréquence et la résolution d'intensité par rapport à une stimulation électrique. Stimulation optogenetic de la voie auditive est très pertinente pour la recherche d'audition. Par exemple, il promet des avancées dans les études sur le raffinement dépendant de l'activité de tonotopie pendant le développement, dans l'analyse de l'exigence d'intégration spectrale dans son localization et de l'étendue de l'interaction entre les projections afférentes fréquence spécifique dans le système auditif central.

Protocol

Toutes les expériences présentées dans cet ouvrage ont été menées avec les normes éthiques définies par la loi allemande sur la protection des animaux de laboratoire. L'Université de Goettingen conseil pour le bien-être des animaux et le bureau de la protection des animaux de l'état de Basse-Saxe ont approuvé les expériences. 1 Préparation de μLED-stimulateur Pour μLEDs, d'abord préparer le stimulateur μLED. Utilisez LED bleues avec 200 par 200 um sur…

Representative Results

Un cochléostomie optimal est essentiel et augmente la probabilité d'une expérience réussie. Cela signifie que la fenêtre est régulière, petite, et il n'y a pas de blessure des structures cochléaires internes. Par exemple, des saignements indique dégâts de la strie vasculaire. Un bon exemple est présenté à la figure 1B. En utilisant des souris transgéniques CHR2, CHR2 est exprimé dans les Sgns l'intérieur de la cochlée <stro…

Discussion

Les expériences décrites démontrent la stimulation des optogenetic Sgns, et peuvent, en principe, également être utilisés pour stimuler les cellules ciliées internes et / ou externes, à condition que l'expression des opsines. Ces expériences nécessitent beaucoup de patience et de soins. Comme mentionné précédemment, les étapes les plus critiques sont une bonne cochléostomie / insertion autour de la fenêtre ainsi que la position et l'orientation appropriée de la source de lumière.

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Materials

Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe