Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.
Ici, nous démontrons la dissection de l'écrevisse abdominale cordon nerveux. La préparation comprend les deux derniers ganglions thoraciques (T4, T5) et la chaîne de ganglions abdominaux (A1 à A6). Cette chaîne de ganglions comprend la partie du système nerveux central (SNC) qui entraîne la locomotion coordonnée des pléopodes (pattes natatoires): le système de swimmeret. Il est connu depuis plus de cinq décennies que, dans chaque écrevisses swimmeret est entraînée par son propre modèle générer noyau indépendant qui génère une activité alternative rythmique 1-3. Les neurones moteurs qui innervent les muscles de chaque swimmeret comprennent deux anatomiquement et fonctionnellement quatre populations distinctes. On est responsable de la rétraction (course de puissance, PS) de la swimmeret. L'autre entraîne l'allongement (de course de retour, RS) de la swimmeret. Les neurones moteurs du système swimmeret sont capables de produire spontanément une configuration de moteur fictif, qui est identique au motif enregistré in vivo </em> 1.
Le but de ce rapport est d'introduire un système de modèle intéressant et pratique pour l'étude des réseaux de production de rythme et la coordination des microcircuits indépendants pour les cours pratiques de laboratoire des élèves. Le protocole fourni comprend des instructions étape-par-étape pour la dissection des abdominale cordon nerveux de l'écrevisse, l'épinglage de la chaîne isolé de ganglions, dégainage les ganglions et l'enregistrement du schéma moteur fictive de pléopodes extracellulaire du système nerveux isolé.
En outre, nous pouvons surveiller l'activité des neurones swimmeret enregistrées intracellulaire de dendrites. Ici, nous décrivons brièvement ces techniques et de fournir quelques exemples. En outre, la morphologie des neurones swimmeret peut être évaluée en utilisant diverses techniques de coloration. Ici, nous donnons des exemples de intracellulaire (par iontophorèse) neurones et remblais de piscines de neurones moteurs swimmeret colorant rempli. Dans notre laboratoirenous utilisons cette préparation pour étudier les fonctions de base de la locomotion fictive, l'effet de rétroaction sensorielle sur l'activité du système nerveux central, et la coordination entre les microcircuits à un niveau cellulaire.
Les natatoires d'écrevisses ont une fonction dans le contrôle de la posture et battent rythmiquement lorsque les animaux nagent en avant, ventiler leurs terriers ou femelles aèrent leurs œufs 5, 6. Les pléopodes de l'écrevisse signal, Pacifastacus leniusculus, se produisent par paires de la deuxième à la cinquième segment abdominal, avec une branche de chaque côté de l'abdomen 7. Le système nerveux central produit de sa propre le crépitement du moteur rythmique qui entraîne le mouvement de swimmeret chez l'animal intact ainsi que dans la préparation nerf cordon isolé. Quand il n'y a pas de rétroaction sensorielle ou décroissant entrée présente le modèle de moteur rythmique produit est appelé la locomotion fictive 1, 2. Dans le système de swimmeret ce modèle de moteur ne diffère pas dans ne importe quel paramètre de l'activité des pléopodes mesurées dans l'animal intact.
Le mouvement de chaque swimmeret est entraîné par un microcircuit qui est situé dans et limité à une corresponding hemiganglion 1 -. 3 Dans chaque microcircuit il ya un noyau de motif génération qui comprend cinq identifiés interneurones de dopage non. Ils peuvent être caractérisés comme étant soit fonctionnellement inhibiteur de Power Stroke (IPS) ou un inhibiteur de la course de retour (IRS) 8. Ces IPS et des interneurones IRS ne sont pas oscillateurs endogènes plutôt leur activité alternatif est entraîné par inhibition réciproque neuf. Parce que ces interneurones inhibent les motoneurones swimmeret directement, l'alternance PS-RS mouvement est généré 10. Locomotion toutefois, ne exige pas seulement la génération de l'activité, mais aussi la coordination des différents microcircuits indépendants. Dans le système de swimmeret telle coordination est établie par le microcircuit de coordination qui garantit que les branches sont actifs à des moments appropriés. Ce microcircuit est construit par trois neurones identifiés dans chaque segment 11-15.
Ce protocole prévoit ee première fois un guide étape par étape la dissection d'isoler la chaîne de ganglions (T4 à A6, Figure 1). Nous montrons comment la broche isolée abdominale cordon nerveux et desheathe chaque ganglion. Dans cette préparation du système nerveux isolé, les neurones responsables du mouvement de swimmeret sont prêts pour une utilisation dans des expériences électrophysiologiques et morphologiques. La deuxième partie de ce protocole montre les principales caractéristiques du modèle de moteur swimmeret. Cela comprend un guide étape par étape pour enregistrer l'activité extracellulaire des neurones moteurs swimmeret. Les axones des neurones moteurs RS projet par la branche antérieure du nerf N1, tandis que les axones des neurones moteurs PS projettent à travers la branche postérieure de la même nerf (Figure 1) 4. Par conséquent, leur activité peut être enregistré à partir de ces branches avec des électrodes à broche différentielles.
<br/> Figure 1: système nerveux isolé à partir de ganglion thoracique 4 (T4) de ganglion abdominal 6 (A6) et un diagramme schématique de ce T4:. Ganglion thoracique 4; T5: ganglion thoracique 5; A1, A2 … A6 du ganglion abdominal 1, ganglion abdominal 2 … ganglion abdominal 6; N1: nerf N1; N2: nerf N2; N3: nerf N3; PS: puissance-temps; RS: retour-course. Abréviations directionnelles: A = antérieure; P = postérieure.
Cette procédure de dissection et la technique électrophysiologique démontré sont pratiques pour les étudiants de premier cycle et peuvent compléter les cours pratiques des étudiants en physiologie. La chaîne isolé des ganglions a été utilisé dans un certain nombre d'expériences pour étudier la fonction du système nerveux, la coordination, ou la modulation de microcircuits swimmeret 6 ainsi que le contrôle neuronal du comportement adaptatif dans la locomotion 16, 17. Le système écrevisses de swimmeret fournit ainsi une énorme quantité de l'enseignement ou t intéressantepleuvoir possibilités qui commencent toutes par la dissection de la corde nerveuse ventrale des écrevisses et l'enregistrement extracellulaire du schéma moteur fictive.
L'anatomie d'écrevisses et de leur ganglions abdominaux a été décrit précédemment 5, 18, 19, 20 et il est recommandé de se familiariser avec eux avant la dissection afin d'éviter la coupe des nerfs importants.
Il est essentiel de garder la préparation à des températures inférieures à 23 ° C pour éviter la dégradation du nerf cordon isolé. Ceci peut être réalisé facilement par le remplacement de la solution de bain de 20 à 30 minutes cha…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Jos Burgert pour aider avec certains des chiffres. Nous sommes reconnaissants à Ingo Selbach (et le groupe "Edelkrebsprojekt NRW») pour ses efforts pour fournir le laboratoire avec des animaux de laboratoire. Nous remercions Anna C. Schneider pour la relecture premières versions du manuscrit. Cette recherche a été financée par une subvention SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 et une subvention de démarrage de l'Université de Cologne pour professeures.
Name of Material/ Equipment | Tipo | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | for extracellular recording | |
air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | for intracellular recording | |
Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A | digitizes recorded signals |
big bucket | filled with ice | |||
Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard | for extracellular recording |
cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 | |
computer and monitor | equipped with recording software | for extracellular recording | ||
container and pipette for liquid waste | ||||
crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | always keep at temperatures ~ 4° C | ||
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 | for intracellular dyefill of neurons |
differential pin electrodes | made from stainless steel ɸ 0.2 mm | for extracellular recording | ||
dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | used in the gross disection | ||
faraday cage | for extracellular recording | |||
fixing pins | for pinning the specimen | |||
forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 | fine forceps: used to pick nerves |
forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 | extra fine forceps: used for desheathing |
forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 | coarse forceps: used to grab specimen and pins |
intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 | for intracellular recording and dyefill of neurons |
Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x – 8x | Leica, Germany | 10446298 | for extracellular recording |
microscope table | for extracellular recording | |||
mirror | to illuminate preparation from below | for extracellular recording | ||
modeling clay | for extracellular recording | |||
Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x – 4.5x | Olympus, Germany | for the dissection | |
petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 | used to pin the isolated chain of ganglia |
ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 | for gross dissection (steps 2.1 – 2.11) |
saline dispenser with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. | Volume ~ 60ml, | used for exsanguination | ||
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 | for desheathing |
stainless steel wire ɸ 0.125 mm | to cut pins of 4-7 mm length | Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany | for pinning of the nerve cord | |
student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 | for gross and fine disection (steps 2.11 – 3.14) |
sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | ||
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip | for extracellular recording |