تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر<em> في المختبر</em> نموذج تجريبي
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
في المختبر ثنائية الأبعاد (2D) الشبكات العصبية بالإضافة إلى مايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) arethe نموذج تجريبي الذهب القياسية المعتمدة لدراسة التفاعل بين الديناميات العصبية والربط الأساسي. خلال تطوير وإعادة الخلايا العصبية الشبكات المعقدة التي تعرض جيدا definedspatio-temporalpatternsof النشاط 1،2 (أي رشقات نارية، رشقات نارية الشبكة، والنشاط ارتفاعه عشوائي). الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسجل النشاط الكهربية من العديد من المواقع (من عشرات الآلاف من الميكروية)، والسماح لتحقيق مفصل لديناميات أعرب على مستوى الشبكة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الثقافات فصلها يجعل المحتملة التي لتصميم الشبكات الهندسية. فمن الأسهل للفهم بهذه الطريقة العلاقات الوظيفية بين النشاط الكهربية تسجيلها والمعلمات من تنظيم الشبكة مثل كثافة الخلية 3، ودرجة نمطية 4،5، وجود غير متجانسة البوب العصبيةulations 6، وما إلى ذلك، تقوم كل الدراسات في المختبر على خلايا المستزرعة نأت على 2D الشبكات العصبية. هذا النهج يؤدي إلى التبسيط فيما يتعلق (في جوهرها 3-الأبعاد، 3D) نظام في الجسم الحي: (ط) في 2D هي بالارض نموذج، somata والنمو الأقماع وثمرة المحاور-التشعبات لا يمكن أن تنتشر في كل الاتجاهات 7. (ب) نمطية 2D في المختبر شبكات المعرض ديناميات الكهربية التي تهيمن عليها تنفجر نشاط يشمل معظم الخلايا العصبية للشبكة 8.
مؤخرا، تم وضع حلول مختلفة للسماح للبناء في المختبر فصل 3D الشبكات العصبية. تتكون فكرة مشتركة في خلق سقالة حيث يمكن للخلايا العصبية تنمو بطريقة 3D. لا يمكن أن تتحقق هذه سقالة مع المواد الهلامية البوليمر والمصفوفات التي يسهل اختراقها الصلبة 13/09. من خلال استغلال الخواص الميكانيكية للبوليمرات، فمن الممكن تضمين الخلايا داخل تساهياكل البريد عن طريق تحديد كتلة موحدة من الثقافات 3D من neurospheres 11. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي ملك الميكانيكية الصارمة للneurospheres 9،12. ومع ذلك، فإن هذه المواد المسامية محدودة، وأنها لا نضمن هجرة الخلايا داخل المصفوفة. للتغلب على هذا العائق، حلا ممكنا يتكون تشريح المصفوفة إلى 'وحدة' وحدات في. لسوء الحظ، يمكن أن حجم وشكل تنوع الجسيمات تعوق التعبئة في الهياكل الطبقات العادية. في 7، كولين وزملاء العمل بتصميم بناء الخلايا العصبية 3D تتكون من الخلايا العصبية و / أو النجمية ضمن الخلية سقالة القائم على المصفوفة النشطة بيولوجيا. هذه الأنسجة العصبية المهندسة سمحت في التحقيقات المختبر لدراسة ومعالجة استجابات العصبية الحيوية داخل البيئات الصغرى 3D. يتكون هذا النموذج من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية توزع في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) و / أو السقالات هيدروجيل (500-600 ميكرون سميكة). في هذا التعاونتم العثور على ndition، وبقاء الخلية المثلى (أكبر من 90٪) من خلال طلاء الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية حول 3750 – 5000 خلية / ملم 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذه القيمة كثافة أقل بكثير من واحد في حالة في الجسم الحي، حيث الكثافة خلية من خلايا القشرة مخ الفأر حوالي 90000 خلية / ملم 3 14. للتغلب على هذا القيد Pautot وزملاء العمل 15 حققت 3D في المختبر نظام حيث يتم التحكم في كثافة الخلايا والاتصال بالشبكة تشبه في ظروف الجسم الحي في حين تمكن في الوقت الحقيقي التصوير من الشبكة. عمليا، يقوم هذا الأسلوب على مفهوم فصل الخلايا العصبية مثقف هي قادرة على النمو على بلي السيليكا. توفر هذه الخرز سطح نمو كبيرة بما يكفي لأجسام الخلايا العصبية على الالتزام وarborizations على النمو، وناضجة، تمديد، وتحديد الاتصالات متشابك على الخلايا العصبية الأخرى. هذا الأسلوب يستغل خصائص التجمع العفوي من الخرز فرقت أحادية لFOالطبقات جمهورية مقدونيا 3D صفائف سداسية تحتوي على مجموعات فرعية متميزة من الخلايا العصبية في طبقات مختلفة مع اتصال مقيدة بين الخلايا العصبية في حبات مختلفة. كانت كثافة الخلايا التي تحققت مع هذا الأسلوب عن 75000 خلية / مم 3.
في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت طريقة Pautot في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 16: وتظهر النتائج أن النشاط الكهربية 3D يعرض ذخيرة واسعة من الأنشطة من واحد التي أعربت عنها الشبكات 2D. ثقافات ناضجة 3D يحمل ديناميكية معززة فيه كل انفجار شبكة وعشوائي تصاعد النشاط جنبا إلى جنب. وبالمثل، تانغ Schomer وزملاء العمل 17 أدرك سقالة مسامية على البروتين والحرير الذي يحافظ على الثقافة القشرية الأولية في المختبر لعدة أشهر، وسجلت النشاط الكهربية عن طريق التنغستن القطب.
في هذا العمل، والإجراءات التجريبية لبناء الشبكات العصبية 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويمكن وصفها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، وهو تجريبية جديدة في منصة المختبر تتكون من 3D هندستها الثقافات العصبية بالإضافة إلى تم تقديمه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لشبكة الكهربية. وقد تم استخدام بلي كما سقالة للسماح ثمرة التهاب الأعصاب على طول ض -axis مصممة لتكون متكاملة مع M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر جورجيو كرليني للدعم الفني في تطوير بنية الحبس وDOTT. أورنيلا LoBrutto لمراجعة شاملة للمخطوطة. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري ال 7 للاتحاد الأوروبي (ICT-FET FP7 / 2007-2013، FET يونغ مخطط المستكشفين) بموجب اتفاقية منحة 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
Riferimenti
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
