Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em> In Vitro</em> Modèle expérimental
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro en deux dimensions (2D), les réseaux de neurones couplés à micro-électrodes (AME) Arrays arethe modèle expérimental étalon-or adoptée pour étudier l'interaction entre les dynamiques neuronales et de la connectivité sous-jacente. Lors du développement, les neurones de recréer des réseaux complexes qui affichent ainsi l'activité definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (ie, des éclats, des éclats de réseau, l'activité de dopage aléatoire). AME enregistrent l'activité électrophysiologique de nombreux sites (de quelques dizaines à des milliers de microélectrodes), permettant une étude détaillée de la dynamique exprimées au niveau du réseau. En outre, l'utilisation de cultures dissociées rend possibile de concevoir-réseaux d'ingénierie. Il est plus facile de comprendre de cette manière les relations fonctionnelles entre l'activité électrophysiologique enregistrées et les paramètres de l'organisation de réseau comme la densité cellulaire 3, degré de modularité 4,5, la présence de la pop neuronale hétérogèneglement 6, etc. Cependant, toutes les études in vitro sur des cellules en culture dissociés sont basés sur des réseaux neuronaux 2D. Cette approche conduit à des simplifications excessives par rapport à la (intrinsèquement 3 dimensions 3D) système in vivo: (i) dans un modèle 2D, Somata et de croissance cônes sont aplaties et l'excroissance des axones-dendrites peut pas se propager dans toutes les directions 7. (ii) 2D in vitro réseaux exposition stéréotypé dynamique électrophysiologiques dominés par l'éclatement activité impliquant la plupart des neurones du réseau 8.
Récemment, différentes solutions ont été développées pour permettre la construction d'dissocié in vitro 3D réseaux neuronaux. L'idée commune consiste à créer un échafaudage où les neurones peuvent se développer dans un mode 3D. Un tel échafaudage peut être réalisé avec des gels de polymères et de matrices poreuses solides 9-13. En exploitant les propriétés mécaniques des polymères, il est possible d'incorporer des cellules à l'intérieur thesstructures de e en définissant un bloc uniforme des cultures 3D de neurosphères 11. La principale caractéristique de cette approche est la propriété mécanique rigide des neurosphères 9,12. Cependant, ces matériaux ont une porosité limitée, et ils ne garantissent pas la migration des cellules à l'intérieur de la matrice. Pour pallier cet inconvénient, une solution possible consiste à découper la matrice en modules de «base». Malheureusement, la taille et la forme de la diversité des particules pourrait entraver l'emballage dans des structures en couches régulières. Dans 7, Cullen et ses collègues ont conçu une construction neuronale 3D constitué de neurones et / ou des astrocytes dans un extracellulaire échafaudage à base de matrice bioactive. Un tel tissu neural conçu permis dans les enquêtes in vitro pour étudier et manipuler les réponses neurobiologiques dans des micro-environnements 3D. Ce modèle est composée de neurones et de cellules gliales distribuées dans toute la matrice extracellulaire (ECM) et / ou des échafaudages d'hydrogel (500 à 600 pm d'épaisseur). Dans ce condition, une viabilité cellulaire optimale (supérieur à 90%) a été trouvée en étalant les cellules à une densité finale d'environ 3750 – 5000 cellules / mm 3. Il est à noter qu'une telle valeur de densité est beaucoup plus faible que celle de la condition in vivo, où la densité de cellules du cortex cérébral de souris est d'environ 90 000 cellules / mm 3 14. Pour surmonter cette limitation Pautot et ses collaborateurs 15 réalisé un système 3D in vitro où la densité cellulaire et la connectivité réseau sont contrôlés à ressembler à des conditions in vivo, tout en permettant l'imagerie en temps réel du réseau. En pratique, ce procédé est basé sur le concept que dissociées sont des neurones en culture capable de croître sur des microbilles de silice. Ces perles offrent une surface assez grande pour les corps cellulaires neuronaux à respecter et pour leurs arborisations à grandir, mûrir, étendre, et de définir des contacts synaptiques avec d'autres neurones croissance. Cette méthode exploite les propriétés d'assemblage spontané de perles mono-dispersées à form 3D couches réseaux hexagonaux contenant des sous-ensembles distincts de neurones sur des couches différentes avec la connectivité entre les neurones contraint sur différentes perles. La densité cellulaire obtenue avec cette méthode était d'environ 75 000 cellules / mm 3.
Récemment, nous avons adapté la méthode de Pautot aux AME 16: les résultats obtenus montrent que l'activité électrophysiologique 3D présente un répertoire plus large d'activités que celui exprimé par des réseaux 2D. Cultures matures 3D présentent une dynamique améliorée dans laquelle les deux rafale de réseau et aléatoire l'activité de pointe coexistent. De même, Tang-Schomer et ses collaborateurs ont réalisé 17 un échafaudage poreux à base de protéine de soie qui maintient une culture corticale primaire in vitro pour plusieurs mois, et enregistré l'activité électrophysiologique à l'aide d'une électrode en tungstène.
Dans ce travail, les procédures expérimentales de construire des réseaux neuronaux 3D couplés à AME sera décrite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, un roman expérimental dans la plateforme vitro constitué de 3D conçu cultures de neurones couplés à AME pour électrophysiologie de réseau a été présenté. L'utilisation des microbilles comme échafaudage pour permettre au long de l'excroissance neuritique axe des z a été adapté pour être intégré avec le MEA plane. De cette façon, les résultats micro-système obtenus dans un modèle in vitro 3D valide et fiable pour étudier la dynamique électro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Giorgio Carlini pour le soutien technique dans l'élaboration de la structure de confinement et Dott. Ornella LoBrutto pour la révision approfondie du manuscrit. La recherche menant à ces résultats a reçu un financement de 7 ème programme-cadre de l'Union européenne (TIC-FET FP7 / 2007-2013, FET Jeunes Explorateurs régime) sous convention de subvention 284772 CERVEAU BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
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