Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em> In Vitro</em> Modelo Experimental
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro de dos dimensiones (2D) redes neuronales acoplados a micro-electrodos Arrays (AMUMA) arethe modelo experimental de oro-estándar adoptado para estudiar la interacción entre la dinámica neuronal y la conectividad subyacente. Durante el desarrollo, las neuronas recrean redes complejas que muestran bien definedspatio temporalpatternsof actividad 1,2 (es decir, las explosiones, las explosiones de red, actividad clavar al azar). AAM registran la actividad electrofisiológica de muchos sitios (de decenas a miles de microelectrodos), lo que permite una investigación detallada de la dinámica expresadas a nivel de red. Además, el uso de cultivos disociados hace possibile para diseñar-redes de ingeniería. Es más fácil de entender de esta manera las relaciones funcionales entre la actividad electrofisiológica registrada y los parámetros de la organización de la red, como la densidad de células 3, grado de modularidad 4,5, presencia de pop neuronal heterogéneaulations 6, etc. Sin embargo, todos los estudios in vitro sobre células cultivadas disociadas se basan en redes neuronales 2D. Este enfoque conduce a simplificaciones con respecto al sistema in vivo (intrínsecamente 3-dimensional, 3D): (I) en un modelo conos, somata de crecimiento y 2D son aplanadas y la consecuencia axones-dendritas no puede extenderse en todas las direcciones 7. (ii) 2D in vitro redes exhibición estereotipada dinámica electrofisiológicos dominadas por la actividad que implica la mayor parte de las neuronas de la red 8 reventar.
Recientemente, diferentes soluciones han sido desarrolladas para permitir la construcción de in vitro 3D disociada redes neuronales. La idea común consiste en crear un andamio donde las neuronas pueden crecer en una forma 3D. Un andamio de este tipo puede realizarse con geles de polímeros y matrices porosas sólidas 9-13. Mediante la explotación de las propiedades mecánicas de los polímeros, es posible incrustar dentro de las células Tse estructuras mediante la definición de un bloque uniforme de las culturas 3D de neuroesferas 11. La característica principal de este enfoque es la propiedad mecánica rígida de las neuroesferas 9,12. Sin embargo, estos materiales han porosidad limitada, y no garantizar la migración de células dentro de la matriz. Para superar este inconveniente, una posible solución consiste en cortar la matriz en módulos "unidad". Por desgracia, el tamaño y la forma de las partículas de diversidad podría obstaculizar el embalaje en estructuras en capas regulares. En 7, Cullen y sus colaboradores diseñaron un constructo neuronal 3D compuesto por neuronas y / o astrocitos dentro de un andamiaje basado en la matriz extracelular bioactiva. Tal tejido neural ingeniería permitido en investigaciones in vitro para estudiar y manipular las respuestas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistía en neuronas y glia distribuidos por toda la matriz extracelular (ECM) y / o andamios de hidrogel (de 500-600 m de espesor). En este condition, una viabilidad celular óptima (mayor que 90%) se encontró en placas células a una densidad final de aproximadamente 3.750 – 5.000 células / mm 3. Debe tenerse en cuenta que un valor tal densidad es mucho menor que el que está en la condición in vivo, donde la densidad de células de la corteza cerebral de ratón es de aproximadamente 90.000 células / mm 3 14. Para superar esta limitación Pautot y compañeros de trabajo 15 se dieron cuenta de un sistema in vitro en 3D donde la densidad celular y la conectividad de red están controlados para asemejarse a las condiciones in vivo al tiempo que permite imágenes en tiempo real de la red. Prácticamente, este método se basa en el concepto de que disocian neuronas cultivadas son capaces de crecer en microperlas de sílice. Estas cuentas proporcionan una superficie de crecimiento lo suficientemente grande para que los cuerpos celulares neuronales para adherirse y para sus arborizaciones para crecer, madurar, ampliar y definir contactos sinápticos con otras neuronas. Este método aprovecha las propiedades de montaje espontáneas de cuentas monodispersados a form 3D en capas matrices hexagonales que contienen distintos subconjuntos de neuronas en diferentes capas con conectividad restringida entre las neuronas en diferentes cuentas. La densidad celular lograda con este método fue de alrededor de 75.000 células / mm 3.
Recientemente, hemos adaptado el método de Pautot los AMUMA 16: los resultados obtenidos muestran que la actividad electrofisiológica 3D presenta un repertorio más amplio de actividades que la expresada por las redes 2D. Culturas maduras 3D muestran una dinámica mejorada en la que tanto la explosión de la red y actividad pico aleatoria coexisten. Del mismo modo, Tang-Schomer y compañeros de trabajo 17 se dieron cuenta de un armazón poroso a base de proteínas de seda-que mantiene una cultura cortical primaria in vitro para algunos meses, y registraron la actividad electrofisiológica por medio de un electrodo de tungsteno.
En este trabajo, los procedimientos experimentales para construir redes neuronales en 3D, junto a los acuerdos ambientales multilaterales se describirá.
Protocol
Representative Results
Discussion
En esta obra, una novela experimental en la plataforma vitro formado por 3D diseñado cultivos neuronales, junto a los acuerdos ambientales multilaterales para electrofisiología red se ha presentado. El uso de microperlas como andamio para permitir la consecuencia a lo largo del eje x neurítico z se ha adaptado para ser integrado con el MEA planar. De esta manera, los resultados obtenidos micro-sistema en un modelo in vitro de 3D válido y fiable para estudiar la din?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Giorgio Carlini por el apoyo técnico en el desarrollo de la estructura de confinamiento y Dott. Ornella LoBrutto para la revisión a fondo del manuscrito. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del 7º Programa Marco de la Unión Europea (TIC-FET FP7 / 2007-2013, FET joven Exploradores esquema) bajo acuerdo de subvención 284.772 CEREBRO DEL ARCO (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
Riferimenti
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