התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em> במבחנה</em> דגם ניסיוני
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
ברשתות מבחנה דו-ממדיות (2D) עצביות מצמידים את מיקרו-אלקטרודה מערכים (MEAs) עלה יפה אימץ ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקה העצבית והקישוריות הבסיסית מודל ניסיוני זהב סטנדרטי. במהלך הפיתוח, נוירונים לשחזר רשתות מורכבות המציגות גם פעילות definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (כלומר, התפרצויות, התפרצויות רשת, פעילות spiking אקראית). MEAs להקליט את פעילות אלקטרו מאתרים רבים (בין עשרות לאלפים microelectrodes), המאפשר חקירה מפורטת של הדינמיקה הביעה ברמת הרשת. בנוסף, השימוש בתרבויות ניתק עושה possibile לעצב מהונדסות-רשתות. זה קל יותר להבין בדרך זו את היחסים הפונקציונליים בין פעילות אלקטרו נרשמה והפרמטרים של ארגון הרשת כמו תא צפיפות 3, מידת המודולריות 4,5, נוכחות של פופ העצבי הטרוגנית6 ulations, וכו 'עם זאת, כל במבחנה בתאים בתרבית ניתקו מבוססת על רשתות עצביות 2D. גישה זו מובילה לפשטנותן ביחס למערכת בvivo (3 ממדים מהותי, 3D): (i) בקונוסים מודל, somata וצמיחת 2D הם שטוחים ותולדת האקסונים-דנדריטים לא יכול להתפשט לכל הכיוונים 7. (Ii) במבחנה תערוכת רשתות 2D סטריאוטיפית דינמיקת אלקטרו נשלטה על ידי מתפוצץ פעילות הכרוכה ברוב הנוירונים של הרשת 8.
לאחרונה, פתרונות שונים פותחו כדי לאפשר הבנייה של במבחנה 3D ניתק רשתות עצביות. הרעיון המשותף מורכב ביצירת פיגום שבו תאי עצב יכולים לגדול בצורה 3D. כגון פיגום יכול להתממש עם ג'לי פולימר ומטריצות נקבוביות מוצקות 9-13. על ידי ניצול התכונות מכאניות של הפולימרים, ניתן להטביע בתוך תאים thesמבני דואר על ידי הגדרת בלוק אחיד של תרבויות 3D של neurospheres 11. התכונה העיקרית של גישה זו היא הרכוש המכני הנוקשה של neurospheres 9,12. עם זאת, חומרים אלה נקבוביות מוגבלים, והם לא מבטיחים נדידת תאים בתוך המטריצה. כדי להתגבר על חסרון זה, פתרון אפשרי מורכב בחיתוך המטריצה לתוך מודולים 'יחידה'. למרבה הצער, את מגוון הגודל וצורה של החלקיקים עלול להקשות על האריזה למבנים שכבתיים רגילים. ב -7, קאלן ועמיתים לעבודה שנועדו לבנות עצבי 3D מורכב מתאי עצב ו / או האסטרוציטים בתוך פיגום מבוסס מטריקס ביו. כגון רקמה עצבית מהונדסת אפשרה בחקירות מבחנה ללמוד ולתפעל תגובות נוירו-ביולוגיות בתוך מיקרו-סביבות 3D. מודל זה מורכב מתאי עצב וגליה מופצים ברחבי המטריצה תאית (ECM) ו / או פיגומי הידרוג'ל (500-600 מיקרומטר עבה). בשיתוף זהndition, כדאיות אופטימלית תא (יותר מ 90%) נמצאה על ידי תאי ציפוי בצפיפות סופית של כ 3,750 – 5,000 תאים / מ"מ 3. יש לציין שערך כגון צפיפות נמוך בהרבה מזה שבמצב in vivo, שבו צפיפות התאים בקליפת מוח העכבר היא כ 90,000 תאים / מ"מ 3 14. כדי להתגבר על מגבלה זו Pautot ועמיתים לעבודה 15 הבינו במבחנה מערכת 3D שבו צפיפות תאים וקישוריות לרשת נשלטות להידמות בתנאי vivo תוך שהוא מאפשרים הדמיה של הרשת בזמן אמת. למעשה, שיטה זו מבוססת על הרעיון שניתק נוירונים בתרבית יכולים לגדול על microbeads סיליקה. חרוזים אלה מספקים משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולarborizations לגדול, בוגר, להאריך, ולהגדיר קשרים סינפטיים לנוירונים אחרים. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה הספונטניות של חרוזים פיזור מונו לFOrm 3D שכבתי מערכי משושים המכילים תת שונה של תאי עצב בשכבות שונות עם קישוריות מוגבלת, בין הנוירונים בחרוזים שונים. צפיפות התאים הושגו בשיטה זו הייתה על 75,000 תאים / מ"מ 3.
לאחרונה, יש לנו השיטה מותאמת של Pautot לMEAs 16: התוצאות שהתקבלו מראות כי פעילות אלקטרו 3D מציגה רפרטואר רחב יותר של פעילויות מזו באה לידי ביטוי על ידי רשתות 2D. תרבויות בוגרות 3D תערוכה דינמית משופר שבה שני פרץ הרשת ולהתקיים פעילות ספייק אקראית. באופן דומה, טאנג-Schomer ועמיתים לעבודה 17 הבינו פיגום נקבובי מבוסס חלבון משי אשר שומר תרבות בקליפת המוח עיקרי במבחנה במשך כמה חודשים, ורשמו את פעילות אלקטרו באמצעות אלקטרודה טונגסטן.
בעבודה זו, הפרוצדורות לבנות רשתות עצביות 3D מצמידים את MEAs יתואר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו, ניסוי חדשני בפלטפורמת מבחנה המורכבת מ3D מהונדס תרבויות עצביות מצמידים את MEAs לאלקטרופיזיולוגיה רשת כבר הציג. השימוש בmicrobeads כפיגום לאפשר תולדת דלקת העצבים לאורך -axis z כבר מותאם להיות משולב עם MEA מישוריים. בדרך זו, תוצאות מיקרו-המערכת שהושגו במבחנת<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ג'ורג'יו Carlini לתמיכה הטכנית בפיתוח מבנה הכליאה וdott. Ornella LoBrutto לתיקון היסודי של כתב היד. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית מסגרת ה -7 של האיחוד האירופי (ICT-FET FP7 / 2,007-2,013, FET צעיר מגלי ערכה) תחת 284,772 BOW BRAIN הסכם מענק (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
Riferimenti
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
