Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em> In Vitro</em> Modello sperimentale
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro bidimensionali (2D) reti neurali accoppiati a micro-elettrodi Array (MEA) arethe modello sperimentale gold-standard adottato per studiare l'interazione tra la dinamica neuronale e la connettività di base. Durante lo sviluppo, i neuroni ricreano reti complesse che mostrano ben definedspatio-temporalpatternsof attività 1,2 (cioè, scoppi, esplosioni di rete, attività chiodare casuale). MEA registrare l'attività elettrofisiologica da molti siti (da decine a migliaia di microelettrodi), che consente un esame approfondito delle dinamiche espresse a livello di rete. Inoltre, l'uso di colture dissociate rende possibile progettare-reti ingegnerizzati. È facile capire in questo modo le relazioni funzionali tra dell'attività elettrofisiologica registrata ei parametri dell'organizzazione network come densità cellulare 3, grado di modularità 4,5, presenza di eterogenea pop neuronaleulations 6, ecc, tuttavia, tutti gli studi in vitro su cellule in coltura dissociate sono basati su reti neuronali 2D. Questo approccio porta a semplificazioni rispetto al sistema in vivo (intrinsecamente 3-dimensionale, 3D): (i) in un modello 2D, somata e coni di crescita sono appiattite e la conseguenza assoni-dendriti non può diffondere in tutte le direzioni 7. (ii) 2D in vitro reti mostra stereotipata dinamiche elettrofisiologiche dominati da scoppio attività che comporti la maggior parte dei neuroni della rete 8.
Recentemente, diverse soluzioni sono state sviluppate per consentire la costruzione di in vitro 3D dissociato reti neuronali. L'idea comune consiste nella creazione di un ponteggio in cui i neuroni possono crescere in modo 3D. Tale impalcatura può essere realizzato con gel polimerici e solidi matrici porose 9-13. Sfruttando le proprietà meccaniche dei polimeri, è possibile incorporare all'interno delle cellule these strutture definendo un blocco omogeneo di culture 3D di neurosfere 11. La caratteristica principale di questo approccio è la proprietà meccanica rigida delle neurosfere 9,12. Tuttavia, questi materiali hanno limitato la porosità, e non garantisce la migrazione delle cellule all'interno della matrice. Per ovviare a questo inconveniente, una possibile soluzione consiste nel tagliare la matrice in moduli 'unità'. Purtroppo, la dimensione e la forma delle particelle diversità potrebbe ostacolare l'imballaggio in strutture stratificate regolare. In 7, Cullen e colleghi hanno progettato un costrutto neuronale 3D fatta di neuroni e / o astrociti all'interno di un ponteggio a matrice extracellulare bioattivi. Tale tessuto neurale progettata consentito di Studi in vitro per studiare e manipolare le risposte neurobiologiche all'interno di micro-ambienti 3D. Questo modello consisteva di neuroni e glia distribuiti in tutta la matrice extracellulare (ECM) e / o ponteggi idrogel (spessore 500-600 micron). In questo condition, una vitalità cellulare ottimale (superiore al 90%) è stato trovato placcando le cellule ad una densità finale di circa 3.750 – 5.000 cellule / mm3. Si deve notare che tale valore di densità è di gran lunga inferiore a quello nella condizione in vivo, in cui la densità delle cellule della corteccia cerebrale mouse è circa 90.000 cellule / mm 3 14. Per superare questa limitazione Pautot e collaboratori 15 realizzato un sistema 3D in vitro dove la densità cellulare e la connettività di rete sono controllati per assomigliare in condizioni in vivo consentendo imaging in tempo reale della rete. In pratica, questo metodo si basa sul concetto che dissociata neuroni in coltura sono in grado di crescere su microsfere di silice. Queste perle forniscono una superficie di crescita abbastanza grande per i corpi cellulari neuronali di aderire e per i loro arborizzazioni per crescere, maturare, estendere, e definire contatti sinaptici con altri neuroni. Questo metodo sfrutta le proprietà di assemblaggio spontanei di perline monodisperse a form 3D strati array esagonale contenenti sottoinsiemi distinti di neuroni su livelli diversi con connettività vincolata tra i neuroni in diverse sfere. La densità cellulare ottenuta con questo metodo è stato di circa 75.000 cellule / mm3.
Recentemente, abbiamo adattato il metodo di Pautot di MEA 16: i risultati ottenuti mostrano che l'attività elettrofisiologica 3D presenta un repertorio più ampia di attività rispetto a quello espresso dalle reti 2D. Culture mature 3D mostrano una dinamica rafforzata cui sia scoppio rete e casuale coesistono attività picco. Analogamente, Tang-Schomer e collaboratori 17 realizzato uno scaffold poroso a base di proteina di seta che mantiene una cultura corticale primaria in vitro per alcuni mesi, e registrato l'attività elettrofisiologica mediante un elettrodo di tungsteno.
In questo lavoro, le procedure sperimentali per costruire reti neuronali 3D accoppiati a MEA sarà descritta.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, un romanzo sperimentale in vitro piattaforma costituita da 3D progettato colture neuronali accoppiati a MEA per elettrofisiologia rete è stata presentata. L'uso di microsfere come impalcatura per consentire la conseguenza neuritica lungo la z -axis è stata adattata per essere integrato con il MEA planare. In questo modo, i risultati ottenuti micro-sistema in vitro modello 3D valida ed affidabile per studiare le dinamiche emergenti elettrofisiologici 16.</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Giorgio Carlini per il supporto tecnico per lo sviluppo della struttura di confinamento e dott. Ornella LoBrutto per l'accurata revisione del manoscritto. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal 7 ° programma quadro dell'Unione europea (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET giovani esploratori schema), contratto di sovvenzione 284.772 CERVELLO ARCO (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
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