Gränssnitt 3D Engineered neuronala kulturer Micro-Elektrod arrayer: Ett innovativt<em> In Vitro</em> Experimentellt
Summary
In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.
Abstract
Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.
Introduction
In vitro tvådimensionella (2D) neurala nätverk kopplade till Micro-Elektrod matriser (MEA) arethe guldstandard experimentell modell som antagits för att studera samspelet mellan neuronala dynamik och den underliggande anslutningsmöjligheter. Under utvecklingen, neuroner åter komplexa nätverk som visar väl definedspatio-temporalpatternsof aktivitet 1,2 (dvs, skurar, nätverk skurar, slumpmässig tillsatta aktivitet). MEA registrera elektrofysiologiska aktivitet från många platser (från tiotals till tusentals mikroelektroder), vilket gör att en detaljerad undersökning av de uttryckta dynamiken på nätverksnivå. Dessutom gör possibile att konstruera manipulerade-nätverk användning av dissocierade kulturer. Det är lättare att förstå på detta sätt de funktionella sambanden mellan den inspelade elektrofysiologiska aktivitet och parametrarna för nätverksorganisationen som celldensitet 3, grad av modularitet 4,5, förekomst av heterogena neuronal populations 6, etc. Men alla in vitro-studier på dissocierade odlade celler baserade på 2D neuronala nätverk. Detta tillvägagångssätt leder till förenklingar med avseende på den (i sig tre-dimensionell, 3D) systemet in vivo: (I) i en 2D-modell, somata och tillväxtkoner är tillplattade och axoner-Dendrites utväxt inte kan spridas i alla riktningar 7. (ii) 2D in vitro nätverk uppvisar stereotypa elektrodynamik domineras av spräng verksamhet som omfattar de flesta av nervceller i nätverket 8.
Nyligen har olika lösningar har utvecklats för att möjliggöra byggandet av in vitro 3D skiljas neuronala nätverk. Den gemensamma idé består i att skapa en byggnadsställning där nervceller kan växa i en 3D-mode. En sådan byggnadsställning kan realiseras med polymergeler och fasta porösa matriser 9-13. Genom att utnyttja de mekaniska egenskaperna hos polymererna, är det möjligt att bädda in celler inuti these strukturer genom att definiera en enhetlig block av 3D-kulturer av neurospheres 11. Det viktigaste inslaget i denna strategi är den styva mekaniska egendom neurospheres 9,12. Emellertid har dessa material begränsad porositet, och de kan inte garantera cell migration inuti matrisen. För att övervinna denna nackdel, en möjlig lösning består i att skära matrisen i "enhet" moduler. Tyvärr kunde storleken och formen mångfald av partiklarna hämmar packningen till vanliga skiktade strukturer. I 7, Cullen och medarbetare utformat en 3D neuronal konstruktion består av nervceller och / eller astrocyter inom en bioaktiva extracellulär matrix-baserade schavotten. En sådan konstruerad nervvävnad tillåts in vitro undersökningar för att studera och manipulera neurobiologiska svar inom 3D mikromiljöer. Denna modell består av neuroner och glia fördelade över hela den extracellulära matrisen (ECM) och / eller hydrogel ställningar (500-600 | im tjock). I detta samarbetendition, en optimal cellviabilitet (större än 90%) erhölls genom utstrykning av celler vid en slutdensitet av cirka 3750 – 5000 celler / mm 3. Det bör noteras att en sådan densitet värde är betydligt lägre än den i in vivo tillstånd, där celldensiteten av musen hjärnbarken är cirka 90000 celler / mm3 14. För att övervinna denna begränsning Pautot och medarbetare 15 realiseras en 3D in vitro-system där celltäthet och nätverksanslutning styrs för att likna in vivo förhållanden samtidigt som realtidsavbildning av nätet. I praktiken är denna metod bygger på konceptet att dissocierade odlade nervceller kan växa på kiselmikropärlor. Dessa pärlor ger en tillväxtytan tillräckligt stor för neuronala cellkroppar att ansluta sig och för deras arborizations att växa, mogen, sträcker sig, och definierar synaptiska kontakter med andra nervceller. Denna metod utnyttjar spontana monteringsegenskaperna hos monodispergerade pärlor att form 3D lager hexagonala matriser som innehåller olika undergrupper av nervceller på olika lager med ansträngd anslutning mellan nervceller på olika pärlor. Den uppnådda celldensiteten med denna metod var ca 75.000 celler / mm3.
Nyligen har vi anpassat Pautot metod för att MEA 16: de erhållna resultaten visar att 3D elektrofysiologiska aktivitet ger en bredare repertoar av aktiviteter än den som uttrycks av 2D-nätverk. 3D mogna kulturer uppvisar en ökad dynamik där både nätverks brast och slump spik aktivitet samexistera. På samma sätt, Tang-Schomer och medarbetare 17 insåg en silkesproteinbaserad porösa byggnadsställning som upprätthåller en primär kortikal kultur in vitro för några månader, och spelade in elektrofysiologiska aktivitet med hjälp av en volframelektrod.
I detta arbete, de experimentella procedurer bygga 3D neuronala nätverk kopplade till MEA kommer att beskrivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete, ett nytt experimentellt in vitro plattform består av 3D konstruerade neuronala kulturer kopplade till MEA för nätverkselektro har presenterats. Användningen av mikropärlor som klätterställning för att tillåta neuritic utväxt längs z-axeln har skräddarsytts för att integreras med den plana MEA. På detta sätt, att de erhållna mikro-system resulterar i en giltig och tillförlitlig in vitro 3D-modell studera framväxande elektrodynamiken 16.
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Giorgio Carlini för tekniskt stöd för att utveckla begränsningsstrukturen och dott. Ornella LoBrutto för grundlig översyn av manuskriptet. Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s 7: e ramprogram (IKT-FET FP7 / 2007-2013 FET Young Explorers system) under bidragsavtal 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).
Materials
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| Trypsin | Gibco | 25050-014 | 0.125% diluted 1:2 in HBSS wo CA++, MG++ |
| DNAase | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05% diluted in Hanks solution |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | culture medium |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% medium supplent |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5mg/liter |
| Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) | Corning Sigma | 481939 | curing agent and the polymer |
| Micro-Electrode Arrays | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA with: Electrode grid 8×8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread |
| Microbead | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1gr Glass Part.Size Stds 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm) |
| HBSS wo Ca++ ,Mg++ | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| Hanks Buffer Solution | Sigma | H8264 | |
| Teflon | Sigma | 430935-5G | polytetrafluoroethylene |
| Rat | Sprague Dawley | Wistar Rat | |
| Confocal Microscopy Upright | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER objective | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER objective | Leica | HCX IRAPO L |
Riferimenti
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
- Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
- Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
- Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
- Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
- Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
- Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cell. , (1998).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
- Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
- Frega, M., et al. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. , 957-960 (2013).
