Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung
Summary
Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.
Abstract
Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.
Introduction
Medizinische Forschung immens aus dem Studium der sowohl menschliche Zelllinien und Tiermodellen profitiert. Zelllinien ermöglichen eine bessere Steuerung der Komponenten in einem System, sowie die Verwendung von Zellen aus dem richtigen Organismus. Arbeiten mit menschlichen Zellen, während repräsentativer, präsentiert eine drastisch vereinfacht Momentaufnahme der Mechanismen, die für die Gesundheit und Krankheit verantwortlich sein können, denn Zelllinien möglicherweise nicht die Auswirkungen von anderen Zellen, Stromazellen Komponenten und Organe, die Reaktionen 1 auswirken können rekapitulieren. Auf der anderen Seite, Tiermodelle, die aber nicht völlig genau bei der Wiedergabe menschlicher Erkrankungen und genetische Heterogenität bieten weitere Einsicht, indem für die Eingabe von ganzen Tiersystemen in den meisten Modellen 2,3.
Mängel beiseite, beide Methoden haben ihre Vorteile und ergänzen. Allerdings bleibt das Hauptziel, die menschliche Zellen und Organen, in einem vollen Körper, Multi-Organ-System zu studieren. Dementsprechend hat der translationalen Forschung taken große Fortschritte bei der Erleichterung der Untersuchung von menschlichen Organen und Geweben von Patienten extrahiert werden, um besser zu verstehen, die Mechanismen zugrunde liegenden Krankheit. Translationale Forschung bietet den Vorteil, das Studium der Folge der Behandlungen und Krankheiten in der gesamten Körper und in geeignete Zellen, wodurch das Beste aus beiden Welten zwischen Zell- und Tier Arbeiten 4.
Translationale Forschung ist auch nicht ohne Mängel. Geernteten Proben von menschlichen Patienten, bei der Entnahme aus dem Host sofort auf Ischämie und andere externe Faktoren, aus denen sie sonst geschützt unterzogen. Dies kann zu Stress-induzierten molekularen und genetischen Veränderungen führen und verursachen Verzerrungen bei der nachfolgenden Studien. Daher wurde viel Mühe in Gewinnung und Verarbeitung Gewebe durch strenge Methoden zur Organ- und Zellintegrität zu bewahren besten für nachgelagerten Studien 5 gesetzt. Wichtig ist, dass zukünftige Anwendungen eng bei der Auswahl von Methoden o berücksichtigt werdenf Verarbeitung menschlichen Proben, wie bestimmte Methoden können sich negativ auf zelluläre Komponenten und Signalwege bei der Sparsamkeit andere.
Für jede Forschung mit menschlichen Geweben, müssen Regulierungsfragen angesprochen werden. Nach den Tuskegee und Belmont Berichte gab es eine wachsende Akzeptanz der Tatsache, dass die biomedizinische Forschung wurde mit inhärenten Risiken häufig zu unvermeidbaren ethischen Dilemmata 6 verbunden. Das Bedürfnis nach nationalen Standards erkannt wurde und die Bundesregierung erstellt Institutional Review Boards (IRBs) als Mittel, um die Prinzipien der Belmont Bericht zu wahren (Achtung der Personen, Wohltätigkeit, Justiz).
IRB jeder Institution ist ein Ausschuss von Ärzten, Forschern und Mitgliedern der Gemeinschaft für den Schutz der Studienteilnehmer verantwortlich sind. Es erfordert, dass freiwillige Zustimmung aller Teilnehmer der biomedizinischen Forschung Studien erhalten werden kann, und dass diese Zustimmung in einer informierten Einwilligung fo dokumentiert werden rm. Die Einwilligungsprozess zielt darauf ab, eine angemessene Information an einen Teilnehmer bereitzustellen, so dass eine fundierte Entscheidung treffen können, ob oder nicht, in einer Studie aufnehmen, oder die Teilnahme fortsetzen werden. In diesem Zusammenhang muss die Einwilligungsdokument gute Lesbarkeit und sollte in der Sprache, die leicht von der Zielgruppe verstanden werden kann (6. bis 8. Klasse Leseniveau) geschrieben werden. Die Möglichkeit, Nötigung oder unzulässigen Beeinflussung minimiert werden müssen, und das Thema muss ausreichend Zeit gegeben, um die Teilnahme zu erwägen. Der Teilnehmer muss außerdem die Möglichkeit haben, ihr Recht auf Zustimmung zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verlaufs der Studie ohne Strafe zurückziehen auszuüben. Freiwillige Einwilligung nach Aufklärung ist eine obligatorische Voraussetzung für die Teilnahme einer Person in der Forschung und es ist auch rechtswirksam 7.
Gemäß den Vorschriften für den Schutz der menschlichen Probanden 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), muss die Studienteilnehmer der Zweck der Untersuchung informiert werden, die Verfahren in der Forschung, Alternativen zur Teilnahme Alle erkennbaren Risiken und Beschwerden (einschließlich nicht nur zu Verletzungen, sondern auch psychologische, soziale oder wirtschaftliche Schaden, Beschwerden oder Unannehmlichkeiten), Nutzen der Forschung für die Gesellschaft und gegebenenfalls für den Einzelnen, wie lange das Thema wird erwartet, zu beteiligen, Person, die Antworten auf Ihre Fragen oder im Falle eines Forschungsbedingten Verletzungen oder Notfall, die Erklärung, dass die Teilnahme freiwillig zu kontaktieren und dass die Weigerung zur Teilnahme werden nicht in irgendwelche Folgen oder den Verlust von Leistungen wie einen Kompromiss in regelmäßigen klinischen Versorgung führen dass die Teilnehmer sonst berechtigt, als Ergebnis seiner / ihrer Diagnosen eine Erklärung über das Recht des Patienten auf Vertraulichkeit und Recht, von zurückzutreten erhalten, und schließlichdie Studie jederzeit ohne Folgen. Gewebeproben von Teilnehmern, die im Verlauf der Studie Einwilligung widerrufen sollte nicht angeschüttet werden und muss sofort verbraucht werden. Verzicht auf eines oder mehrere Elemente der Einwilligung kann von dem IRB für einige Forschungsprojekte, die in der Praxis nicht ohne eine Änderung der benötigten Elemente oder für Untersuchungen, bei denen erforderlichen Elemente sind nicht anwendbar getan werden konnte, erhalten werden. Muss darauf geachtet werden, um die Vertraulichkeit der Daten zu gewährleisten. Der Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) ist ein Bundesgesetz, das der Nutzung oder Offenlegung "geschützte Gesundheitsdaten" (PHI) ohne schriftliche Genehmigung von den Teilnehmern verhindert. PHI umfasst, ist jedoch nicht zu Gesundheitsinformationen übertragen lassen oder in irgendeiner Form oder Medium und enthält Felder, die verwendet werden könnten, um eine individuelle Identifizierung 9 begrenzt.
Durch diese Arbeit wollen wir das Protokoll, die während tissu befolgt werden müssen skizzierene Verarbeitung – einschließlich der Beschaffung und Lagerung und betonen, wie wichtig die folgenden strengen Richtlinien, um die Verzerrungen, die durch die Spannungen ein Gewebe, auf Extraktion unterworfen führen können, zu minimieren. Wir bemühen uns auch um eine kurze Übersicht über die nachgeschaltete Tests oder Analysen (Abbildung 1), die auf solchen Proben durchgeführt werden könnte, so dass Leser können eine qualifizierte Entscheidung über welche Assay (n) am besten ihren Bedürfnissen zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Letztlich müssen die Verfahren zur Verarbeitung von durch die gewünschte Hypothese diktiert und erwarteten technischen Assays (Figur 1) ausgeführt werden kann. Der folgende Abschnitt dient als Überblick über potenzielle Assays, die auf solchen Gewebeschnitten durchgeführt werden können, zu beschreiben. Es ist keineswegs eine erschöpfende Übersicht, sondern soll Führungsprobenverarbeitungsmethoden und Wahl der Downstream-Assays mit der Beschreibung Techniken und Listing ihre Stärken und Schwä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der philanthropischen Beiträge der John G. und Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grants # 0727033) und dem Melanoma Research Alliance unterstützt. Die Autoren danken der University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) für die Koordinierung der Gewebeverteilung und Sammlung und die Erleichterung der translationalen Forschung, wie Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, dem MD Anderson Cancer Center Department of danken, sowie Pathologie und der Melanom-Mond-Schuss-Programm. Schließlich sind die Autoren danken allen Patienten und Familien, die von Melanom betroffen anzuerkennen.
Materials
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
Riferimenti
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