마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
핵 봉투 (NE)는 세포질에서 핵질을 분리한다. 그것은 핵 구멍에 연결하는 내부 및 외부 핵 막 (INM 각각 ONM)로 구성되어있다. 모두 멤브레인로 구분 루멘은 핵 주변 공간 (PNS)라고합니다. ONM 러프 소포체 (ER)의 연장이고, INM 핵 박판에 부착, A- 및 B 형으로 표현 핵-V 형 중간 필라멘트 그물 세공은 1,2 라민. Nucleoskeleton 및 세포 뼈대 (LINC) 복합체의 링커는 물리적 골격 필라멘트 및 분자 모터 (그림 1A)에 핵의 내부를 연결하는 전체 핵 봉투에 걸쳐 거대 분자 어셈블리입니다. 일 (SAD1 / Unc84) 단백질과 Nesprins (핵 봉투 SPectRINS) : 그들은 NE의 통합 횡단 단백질의 두 가족의 특성을 진화 적으로 보존 모티브 사이의 상호 작용으로 구성되어 있습니다. 포유 동물에서, Sun1 Sun2에 ARN 말단 영역 nucleoplasmic A- 및 B 형 라민 3-5와 직접 상호 작용 INM의 E 막 횡단 단백질. PNS 내 INM의 다른 측면에서, 썬 단백질은 150 C- 말단 아미노산이 태양 도메인이라고 ~의 진화 – 보존 스트레칭 항구. SUN 도메인은 진화 – 보존 KASH와 직접 상호 작용 (Klarsicht / ANC-1, 영신의 인사 상동) 도메인, Nesprins의 분자 서명. KASH 도메인은 막 횡단 도메인 (6) 다음에 PNS 내로 돌출 ~ 30 C 말단 아미노산 스트레치로 구성된다. 적어도 네 가지 Nesprin 유전자 (Nesprin1-4)는 NE 7에서 지역화 단백질을 KASH 함유 인코딩. 놀라운 1,000 kDa의 (Nesprin1 거인)에 크기가 달라질 ~ 50kDa (Nesprin4)에서 Nesprins의 세포질 영역은 여러 스펙 트린은 액틴, plectin 및 분자 모터 8과 같은 세포 골격의 구성 요소와 상호 작용을 가능하게 반복뿐만 아니라 특정 주제 포함 (13).
<척추 동물과 무척추 동물의 P 클래스 = "jove_content"> 연구 라민 / 일 / Nesprin / 분자 모터는 진화 적으로 보존 된 "축"핵 이동과 고정을 제어를 구성하는 것으로 나타났습니다. LINC 복잡한 구성 요소의 여러 녹아웃 (KO) 마우스 모델을 설명하고 포유류의 개발 9,14,15시 (NE)에서 태양과 Nesprin 단백질의 역할을 이해하는 프레임 워크를 제공하는 수단이되었다되고있다. 그러나, 이러한 모델 특히 현재 몇 가지 중요한 단점 :의 표현형 기여 구별 비 자치 효과, 2) 어려움을 세포에 의한 표현형 해석 1) 어려움 KASH없는 Nesprin 대 KASH이 함유, 3) 16 이소 폼 다양한 세포 유형의 NE에서 태양과 Nesprin 단백질의 기능 중복은 모두의 KASH 도메인에 대한 결핍 마우스 (17)의 모든 SUN-KASH 상호 작용과 마우스의 4) 주 산기 치사를 비활성화하는 복잡한 번식 체계를 필요Nesprins1 2는 성인의 분석 18 표현형을 배제한다.이 프로토콜은 따라서 위에서 설명한 단점이 많은 우회, 셀 자율과 발달 규제 방식으로 생체 내에서 모든 Sun-KASH 상호 작용을 방해하기 위해 설계된 새로운 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이는 Cre 호텔 / LOX 계 마우스 모델은 두 개의 중요한 개념에 의존한다 : 1) 공지 Nesprin 단백질 KASH 도메인은 세포 배양 시스템에서 NE에 EGFP 타겟팅 및 2) 일 도메인이 과발현 따라서 KASH 도메인으로 이것은 무작위 상호 작용하기에 충분한 어떤 KASH 도메인은 모든 내생 일 도메인을 포화과 지배적 인 음성 방식 (17) (그림 1B)에 LINC 복합체를 비활성화합니다. 이 프로토콜은 조직 수확 및 소뇌 조롱박 세포의 모든 SUN-KASH 상호 작용의 중단을 확인하는 데 사용 처리 단계를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가장 중요한 단계는 성공적으로의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 모델이 적합 Cre 호텔 마우스 라인 (들)을 식별하는 것입니다 사용하여 생체 내에서 LINC 복합체의 역할을 연구합니다. Cre 호텔 유사한 경로에 관여하는 다른 세포 유형에서 활성 상태 인 경우 사실, 그것은 결과의 해석을 복잡하게 할 수 있습니다. 소뇌 (도 2B)의 분자량 및 과립 세포층 여기에 도시 된 바와 같이, 따라?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 (학과 안과 및 Visual 과학)과 의학의 세인트 루이스 학교 워싱턴 대학에서 마우스 유전학 코어의 분자 유전학 코어, 형태 및 이미지 코어의 직원을 감사드립니다. 저자는 세포에 대한 맥도넬 센터 및 분자 신경 생물학, 신경 장애에 대한 희망 센터에서 작은 보조금 프로그램에 의해 지원, 국립 안과 연구소 (DH에 # R01EY022632), 국립 안과 연구소 센터 코어 그랜트 (# 1 P30EY002687) 및 연구에서 무제한 부여 안과 및 Visual 과학 부서에 실명을 방지합니다.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
Riferimenti
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