Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
Ядерная оболочка (СВ) отделяет нуклеоплазму из цитоплазмы. Она состоит из внутреннего и внешнего ядерной мембраны (ИВМ и ONM, соответственно), которые подключаются на ядерные поры. Просвет очерчены обе мембраны называют перинуклеарном пространстве (ПНС). ONM является продолжением шероховатой эндоплазматической сети (ER), и ИВМ придерживается ядерной пластинки, сетчатая промежуточных филаментов ядерной типа V представлена А- и В-типа Ламины 1,2. Линкеры в нуклеоскелета и цитоскелета (ЛИНК) комплексов макромолекул сборки, которые охватывают весь ядерный конверт физически подключить интерьер ядра в цитоскелета нитей и молекулярных моторов (Рис. 1А) Они состоят из взаимодействий между эволюционно консервативных мотивов, которые характеризуют два семейства интегральных трансмембранных белков NE: Солнце (SAD1 / Unc84) белки и Nesprins (ядерная оболочка SPectRINS). У млекопитающих, sun1 и Sun2 сотоке трансмембранных белков НИМ которого N-терминал нуклеоплазме область взаимодействует непосредственно с А- и В-типа ламинов 3-5. С другой стороны, в INM ПНС, Sun белки питают эволюционный-сохраняется участок ~ 150 С-концевых аминокислот называется областью вс SUN домены непосредственно взаимодействуют с эволюционно-консервативными каш (Klarsicht / ANC-1, старое время гомология) домена, молекулярная подпись Nesprins. Кэш домены состоят из участка ~ 30 C-концевых аминокислот, который выступает в ПНС последующим трансмембранного домена 6. По крайней мере, четыре различных генов Nesprin (Nesprin1-4) кодирования KASH содержащие белки, которые локализуются на северо-востоке 7. Цитоплазматические регионы Nesprins, чьи размеры варьируются от ~ 50kDa (Nesprin4) к удивительным 1000 кДа (Nesprin1 гигантского), содержат несколько спектрин повторяет, а также конкретные мотивы позволяет их взаимодействие с цитоскелета компонентов, таких как актин, плектина и молекулярных моторов 8- 13.
<р = класс "jove_content"> Исследования в позвоночных и беспозвоночных животных показали, что Ламин / ВС / Nesprin / молекулярные моторы представляют собой эволюционно консервативный "ось" контрольный ядерной миграции и крепление. Несколько нокаут (КО) мышиных моделях ЛИНК сложных компонентов были описаны и сыграли важную роль в обеспечении рамок для понимания роли Солнца и Nesprin белков на северо-востоке в ходе развития млекопитающих 9,14,15. Тем не менее, эти модели представляют несколько существенных недостатков, в первую очередь: 1) сложности в интерпретации фенотипы в связи с клеточной неавтономных эффектов, 2) трудности в различении фенотипическую вклад каш, содержащих против KASH-менее Nesprin изоформы 16, 3) функциональная избыточность Sun и Nesprin белков в NE в многочисленных типов клеток требует сложных схем разведения, чтобы инактивировать все взаимодействия ВС-Каш у мышей 17 и 4) перинатальный летальность мышей с дефицитом в KASH-области иNesprins1 и 2 исключает анализ взрослого фенотипы 18.Этот протокол описан новый модель мыши, предназначенный для разрушения всех взаимодействий ВС-каш в живом организме, в клетке автономным и развитием регулируемым образом, минуя многие из недостатков, описанных выше. Это / LOX-ориентированная модель мыши Cre опирается на два важных концепций: 1) домен KASH любого известного белка Nesprin достаточно целевой EGFP в NE в системах клеточных культур и 2) SUN домены взаимодействуют разбора с KASH доменов, таким образом, избыточная экспрессия любой домен KASH будет насыщать все эндогенные SUN домены и инактивировать ЛИНК комплексы доминантно-негативной манере 17 (рис 1B). Этот протокол описывает сбор тканей и этапы обработки, используемые для подтверждения нарушения всех взаимодействий ВС-KASH в мозжечка клеток Пуркинье.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным шагом для успешного изучения роли ЛИНК комплексов в естественных условиях, используя (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) модель ТГ является определение подходящего мыши линии (ы) CRE. В самом деле, если Cre активен в других типов клеток, участвующих в подобных путей, это может усложнить инте…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность сотрудникам ядра морфологический и изображений, ядра Молекулярная генетика (Отдел офтальмологии и визуальных наук) и мыши генетики Ядра в Вашингтонском университете в Сент-Луисе школы медицины. Авторы поддержке программы малых грантов от McDonnell Центра клеточной и молекулярной нейробиологии, Надежда Центра неврологических расстройств, Национальный институт глаз (# R01EY022632 ЦТ), Национальный институт глазной центр Основные Грант (# P30EY002687) и неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты в отделении офтальмологии и визуальных наук.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
Riferimenti
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
