Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
La envoltura nuclear (NE) separa el nucleoplasma del citoplasma. Se compone de una membrana nuclear interna y externa (INM y ONM, respectivamente) que se conectan en los poros nucleares. El lumen delimitado por ambas membranas se llama el espacio perinuclear (PNS). La ONM es una extensión del retículo endoplásmico rugoso (ER), y el INM se adhiere a la lámina nuclear, una malla de tipo nuclear-V filamentos intermedios representado por A y de tipo B laminas 1,2. Enlazadores de los complejos Citoesqueleto (LINC) nucleoesqueleto y son conjuntos macromoleculares que abarcan toda la envoltura nuclear para conectar físicamente el interior del núcleo a los filamentos del citoesqueleto y motores moleculares (Figura 1a). Se componen de interacciones entre evolutivamente conservados motivos que caracterizan a dos familias de proteínas transmembrana integrales de la NE: Sol (sad1 / Unc84) proteínas y Nesprins (Nuclear Sobre SPectRINS). En los mamíferos, Sun1 y Sun2 arproteínas transmembrana e del INM cuyo N-terminal nucleoplasmic región interactúa directamente con A y laminas de tipo B 3-5. En el otro lado del INM, dentro del PNS, las proteínas Sun Harbor un estiramiento-evolutiva conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminal llamado el dominio dom Dominios SUN interactúan directamente con la KASH-evolutiva conservada (Klarsicht / ANC-1, Syne homología) de dominio, la firma molecular de Nesprins. KASH dominios consisten en un tramo de ~ 30 aminoácidos C-terminal que sobresale en el PNS seguido por un dominio transmembrana 6. Al menos cuatro genes nesprin distintas (Nesprin1-4) codifican KASH contienen proteínas que se localizan en el NE 7. Las regiones citoplasmáticas de Nesprins, cuyos tamaños varían de ~ 50 kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (gigante Nesprin1), contienen múltiples espectrina repite, así como los motivos específicos que permite su interacción con los componentes del citoesqueleto, tales como actina, plectina y motores moleculares 8- 13.
<p class = "jove_content"> Estudios en vertebrados e invertebrados han mostrado que Lamin / Sun / nesprin / motores moleculares constituyen un "eje" conservadas evolutivamente controlar la migración nuclear y anclaje. Varios knock-out (KO) modelos de ratón de componentes complejos LINC se han descrito y fueron fundamentales en la prestación de un marco para comprender las funciones de las proteínas Sol y nesprin en el NE durante el desarrollo de los mamíferos 9,14,15. Sin embargo, estos modelos presentan varios inconvenientes significativos, sobre todo: 1) de dificultad en la interpretación de los fenotipos debido a la celda efectos no autónomos, 2) la dificultad para distinguir las contribuciones fenotípicas de KASH contienen vs. KASH menos nesprin isoformas 16, 3) la redundancia funcional de las proteínas Sun y nesprin en el NE en numerosos tipos de células requiere esquemas de mejoramiento complejos para inactivar todas las interacciones dom-KASH en ratones 17 y 4) la letalidad perinatal de ratones deficientes para el KASH-dominio de ambosNesprins1 y 2 impide el análisis de adultos fenotipos 18.Este protocolo describe un modelo de ratón novedoso diseñado para interrumpir todas las interacciones dom-KASH in vivo, en una célula de manera autónoma y regulado por el desarrollo, evitando así muchos de los inconvenientes descritos anteriormente. Este / modelo de ratón basada en lox Cre se basa en dos conceptos importantes: 1) el dominio KASH de cualquier proteína nesprin conocido es suficiente para dirigir EGFP a la NE en sistemas de cultivo celular y 2) dominios SUN interactuar promiscuamente con dominios Kash, por tanto, la sobreexpresión de cualquier dominio KASH saturará todos los dominios SUN endógenos e inactivar complejos LINC de una manera dominante negativo 17 (Figura 1B). Este protocolo describe la cosecha de tejidos y etapas de procesamiento utilizadas para confirmar la interrupción de todas las interacciones dom-KASH en las células de Purkinje del cerebelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso más crítico para estudiar con éxito el papel de los complejos de LINC in vivo utilizando el modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) es identificar una línea de ratones Cre adecuado (s). En efecto, si Cre está activo en otros tipos de células implicados en las vías similares, se puede complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es importante examinar las células cercanas, como se muestra aquí en las capas celulares moleculares y granulares del cerebelo (Figura 2B).</strong…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal del núcleo Morfología e Imagen, del núcleo de Genética Molecular (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales) y del ratón Genética Core en la Universidad de Washington en St. Louis Escuela de Medicina. Los autores son apoyados por el programa de pequeñas donaciones del centro McDonnell Celular y Neurobiología Molecular, el Centro Esperanza de Trastornos Neurológicos, el Instituto Nacional del Ojo (# R01EY022632 a DH), un Instituto Oftalmológico Centro Nacional Core Grant (# P30EY002687) y un subvención sin restricciones de Investigación de Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
Riferimenti
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