Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch
Summary
Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.
Abstract
Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.
Introduction
Die Kernhülle (NE) trennt das Kernplasma aus dem Zytoplasma. Es besteht aus einem inneren und äußeren Kernmembran (INM und ONM, respectively), die an Kernporen verbinden zusammen. Das Lumen von beiden Membranen abgegrenzt wird als perinukleären Raum (PNS). Die ONM ist eine Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der INM haftet an der Lamina, um ein Maschenwerk des Typs V-Atom Intermediärfilamente von A- und B-Typ dargestellt Lamine 1,2. Linker der Nucleoskeleton und Zytoskelett (LINC) -Komplexe sind makromolekularer Komplexe, die die gesamte Kernhülle überspannen kann, um das Innere des Kerns physikalisch verbinden Zytoskelettfilamenten und molekularen Motoren (1A). Sie bestehen aus Wechselwirkungen zwischen evolutionär konservierte Motive, die zwei Familien von integralen Transmembranproteine des NE charakterisieren: Sun (SAD1 / Unc84) Proteine und Nesprine (Nuclear Envelope Spek). Bei Säugetieren Sun1 und Sun2 are Transmembranproteine des INM, deren N-terminale nukleoplasmatischen Region interagiert direkt mit A- und B-Typ Lamine 3-5. Auf der anderen Seite des INM, im PNS, Hafen Sun Proteine einen evolutionären konserviert Strecke von ~ 150 C-terminalen Aminosäuren genannt SUN-Domäne. SUN Domänen interagieren direkt mit dem evolutionären konserviert KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologie) -Domäne, die molekulare Signatur der Nesprine. KASH Domänen bestehen aus einer Strecke von ca. 30 C-terminalen Aminosäuren, die in die PNS, gefolgt von einer Transmembran-Domäne 6 ragt. Mindestens vier verschiedene Nesprin Gene (Nesprin1-4) kodieren KASH haltige Proteine, die an der NE 7 lokalisieren. Die zytoplasmatischen Regionen Nesprine, deren Größen variieren von ~ 50 kDa (Nesprin4) zu einer erstaunlichen 1.000 kDa (Nesprin1 giant) enthalten mehrere Spektrin wiederholt sowie spezifische Motive, damit ihre Wechselwirkung mit Zytoskelett-Komponenten, wie beispielsweise Actin, plectin und molekularen Motoren 8- 13.
<p class = "jove_content"> Studium in Wirbeltieren und wirbellosen Tieren haben gezeigt, dass Lamin / Sun / Nesprin / molekulare Motoren stellen eine evolutionär konservierte "Achse" Steuerung Kern Migration und Verankerung. Einige Knock-out (KO) Maus-Modellen der LINC komplexe Bauteile wurden beschrieben und waren maßgeblich an der Schaffung eines Rahmens, um die Rolle von Sun und Nesprin Proteine an der NE während der Entwicklung von Säugetieren 9,14,15 zu verstehen. Allerdings sind diese Modelle weisen mehrere signifikante Nachteile auf, insbesondere: 1) Schwierigkeiten bei der Interpretation Phänotypen aufgrund der nicht autonomen Effekte, 2) Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der phänotypischen Beitrag von Zell KASH haltigen vs. KASH losen Nesprin Isoformen 16, 3) die funktionelle Redundanz von Sonne und Nesprin Proteine an der NE in zahlreichen Zelltypen erfordert komplexe Zuchtprogramme, alle SUN-KASH Wechselwirkungen bei Mäusen 17 und 4) die perinatale Sterblichkeit von Mäusen mangelhaft für die KASH-Domäne sowohl inaktivierenNesprins1 und 2 schließt die Analyse der Erwachsenen Phänotypen 18.Dieses Protokoll beschreibt ein neues Mausmodell entwickelt, um alle SUN-KASH Wechselwirkungen in vivo stören, in einer Zelle autonom und entwicklungsregulierter Weise umgehen somit viele der oben beschriebenen Nachteile. Diese Cre / lox-basierten Mäusemodell beruht auf zwei wichtige Konzepte: 1) die KASH Domäne von irgendeinem bekannten Nesprin Protein ausreicht, um EGFP auf die NE in Zellkultursystemen Ziel und 2) Sonnendomänen interagieren promiscuously mit KASH Bereichen, wodurch eine Überexpression von beliebige KASH Domäne werden alle endogenen SUN Domänen zu sättigen und zu inaktivieren LINC-Komplexe in einer dominant-negative Art und Weise 17 (1B). Dieses Protokoll beschreibt Gewebe Ernte- und Verarbeitungsschritte verwendet werden, um die Störung aller SUN-KASH Wechselwirkungen im Kleinhirn-Purkinje-Zellen bestätigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Schritt, um erfolgreich zu studieren die Rolle des LINC-Komplexe in vivo unter Verwendung der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Modell ist, um eine geeignete Cre Mauslinie (n) zu identifizieren. In der Tat, wenn Cre ist in anderen Zelltypen in ähnlicher Wegen beteiligt aktiv, es kann die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Daher ist es wichtig, in der Nähe von Zellen zu untersuchen, wie hier in der molekularen und Körnerzellschicht des Cerebellums (2B) dargestellt. Ebenso ist e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Morphologie und Imaging-Kern, der Molekulargenetik Kern (Abteilung für Augenheilkunde und Visual Sciences) und der Mausgenetik Kern an der Washington University in St. Louis School of Medicine. Die Autoren werden von der kleinen Zuschuss-Programm von der McDonnell Zentrum für Zelluläre und Molekulare Neurobiologie, der Hoffnung Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt das National Eye Institute (# R01EY022632 zu DH), ein National Eye Institute zentralen Kern Grant (# P30EY002687) und eine zweckgebundene Zuwendung der Forschung, um Blindheit zu der Augenklinik und Visual Sciences verhindern.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Adhesion Slides | StatLab | M1000W | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anti-Calbindin Antibody | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anti-EGFP Antibody | Abcam | ab13970 | |
| Anti-Nesprin2 Antibody | Previously described in Ref. 21 | ||
| Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | |
| 2-methyl butane | Sigma Aldrich | O3551 |
Riferimenti
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
- Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
- Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
- Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
- Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
- Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
- Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
- Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
- Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
- Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
- Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
- Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
- Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
- Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
- Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
- Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
- Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
- Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180 (2012).
- Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).
