Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine per cristallizzazione
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
La comprensione della struttura delle proteine a livello atomico è la chiave per scoprire le basi molecolari dei percorsi e delle malattie biologiche. X-ray cristallografia di proteine è il / metodo applicabile più ampiamente usato per determinare le strutture macromolecolari. La sfida principale di questo metodo è l'ottenimento di una quantità sufficiente di propriamente piegato, proteina pura. Questo diventa un problema particolare quando si lavora con le proteine secrete di mammifero, che subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali.
Proteine batteri-espresse sono la fonte primaria di proteine cristallizzate depositate nel Protein Data Bank 1. Sistemi di espressione batterici sono largamente preferibili perché sono veloci, poco costosi e producono tipicamente alte rese di proteine. Tuttavia, i domini extracellulari di proteine di mammifero espresse in batteri sono spesso non correttamente ripiegate, in cui sono richiesti caso refolding ed estesa purificazione passi per ottenere omogeneamente foproteine lded. Inoltre, molte proteine di mammiferi necessitano di glicosilazione post-traslazionale per ottenere una corretta piegatura 2. Anche se l'espressione e glicosilazione in cellule di lievito o di insetto in grado di superare il problema ripiegamento, modificazioni post-traslazionali, tra cui glicosilazione, differiscono significativamente da quelle delle cellule di mammifero 3, producendo proteine con modifiche non corrette o non omogenei.
Le cellule di mammiferi esprimono tutta la macchinario molecolare necessario per garantire un'adeguata modificazioni post-traslazionale e pieghevoli; Tuttavia, questi sistemi di espressione non sono tipicamente preferiti dalla maggior parte laboratori, a causa di rendimenti limitati e costi elevati di reagenti e materiali di consumo. Polietilenimmina (PEI), un reagente di trasfezione standard è relativamente a buon mercato, ma impone una notevole citotossicità e la bassa efficienza di trasfezione, con conseguente aumento dei costi a supporto delle cellule, il DNA, e attrezzature coltura. Molte alternative al PEI sono proibitivi. Ci rivolgiamoquesti problemi descrivendo una combinazione di migliori strumenti di coltura cellulare e chimicamente modificati PEI per il metodo rapido e relativamente poco costoso per l'espressione di proteine secrete mammifero, seguita da purificazione passo singolo. Questo metodo robusto fornisce rendimenti sufficienti per studi funzionali e biochimici 4, e in alcuni casi, si traduce in proteine suscettibili di cristallizzazione senza ulteriore purificazione.
Questo protocollo descrive diverse tecniche per massimizzare l'espressione e la resa per le proteine di mammiferi secrete nel rene embrionali umane (HEK) 293F cellule coltivate in sospensione. Efficienza di trasfezione (e costo), la produzione di proteine e purificazione sono tutti sempre maggiore seguendo questo protocollo. PEI modificato con l'aggiunta di carbammati per reazione apertura d'anello singolo step (PEI-TMC-25, sintesi e proprietà descritte in dettaglio ref 5) migliora notevolmente l'efficienza di trasfezione, riduce la citotossicità da cationicorottura della membrana e di conseguenza riduce i costi di sperimentazione. Inoltre, la vitalità cellulare e l'espressione della proteina sono notevolmente migliorate con l'aggiunta di supplementi di coltura per la fornitura di glucosio e vitamine. È importante sottolineare che per la produzione di proteine glicosilate, il trattamento con kifunensine, un inibitore chimico non tossico di Mannosidase I, produce proteine con definite, glycans immaturi, che possono essere rimossi dal EndoHf endoglicosidasi per produrre proteine con un singolo N-acetilglucosamina al posto di un full-length glicano 6 N-linked. Infine, la secrezione di proteine in un mezzo chimicamente definito privo di siero consente purificazione rapida e facile per studi strutturali e biochimici. Single-step acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA) purificazione resina rimuove la maggior parte dei contaminanti specie nel surnatante e, in alcuni casi, può produrre proteine di purezza sufficiente per cristallizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellule HEK 293F offrono produzione robusta di proteine che richiedono modificazioni post-traslazionali. Questo sistema permette l'espressione rapida e scalabile di proteine ripiegate in modo nativo contenenti disolfuri, glicosilazione e fosforilazione che altrimenti assente utilizzando più strumenti di espressione di routine. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per l'espressione e la purificazione di complessi multi-proteici semplicemente co-trasfezione di plasmidi multipli. Oltre TREM2,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Riferimenti
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