효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
원자 수준에서 단백질의 구조를 이해하는 것은 생물학적 경로와 질병의 분자 기반을 폭로의 핵심입니다. X 선 결정학은 단백질 거대 분자의 구조를 결정하기위한 가장 널리 사용 / 적용 가능한 방법이다. 이 방법의 가장 큰 문제는 제대로 접혀, 순수한 단백질의 충분한 양을 얻을 수있다. 특히 특정 번역 후 수정을 거쳐 분비 포유류 단백질, 작업 문제가된다.
세균 발현 단백질은 단백질 데이터 뱅크 1에서 증착 된 결정화 된 단백질의 주요 원이다. 그들은 저렴하고, 빠르고 일반적으로 단백질의 높은 수율을 생산하기 때문에 세균 발현 시스템은 크게 바람직하다. 그러나, 박테리아에서 발현 포유류 단백질의 세포 외 도메인은 종종 제대로 fo를 균일하게 얻기 위해하는 경우 폴딩 및 광범위한 정화 단계가 필요, 접힌되지 않습니다lded 단백질. 또한, 많은 포유류 단백질은 적절한 폴딩 2를 달성하기 위해 번역 후 당화가 필요합니다. 효모 또는 곤충 세포에서의 발현은 글리코 실화 및 접힘 문제를 극복 할 수 있지만, 당화 포함 번역 후 변형은, 부정확 한 또는 불균일 한 변형을 가진 단백질을 수득 포유류 세포 (3)의 것과 크게 다르지.
포유 동물 세포가 적절한 번역 후 변형 및 폴딩을 위해 필요한 모든 분자 기계를 표현; 그러나, 이러한 발현 시스템은 전형적으로 제한 수율 및 시약 및 소모품의 높은 비용, 대부분의 실험실에서 바람직하지 않다. 폴리에틸렌 이민 (PEI)는 표준 트랜 스펙 션 시약을 비교적 염가이지만 상당한 독성, 낮은 형질 감염 효율, 셀 매체, DNA의 비용 상승을 초래하고 장비의 배양을 부과한다. PEI에 많은 대안이 엄청나게 비싸다. 우리는 해결개선 된 세포 배양 용 도구의 조합을 나타내는 화학적, 단일 단계 정제 한 후, 분비 된 포유 동물 단백질의 발현을위한 신속하고 비교적 저렴한 방법에 대한 PEI를 수정함으로써 이러한 문제. 이 방법은 강력한 기능, 생화학 적 연구 4 충분한 수율을 제공하고, 어떤 경우에는, 추가의 정제없이 결정화 의무가 단백질을 초래한다.
이 프로토콜은 표현을 극대화하고 정지에서 재배 인간 배아 신장 (HEK)에서 분비 포유류 단백질 293F 세포 산출하기 위해 여러 가지 기술에 대해 설명합니다. 형질 전환 효율 (비용), 단백질 생산 및 정제 모두 크게이 프로토콜에 따라 향상됩니다. 단일 단계의 개환 반응을 통해 카바 메이트의 추가에 의해 변형 된 PEI는 (PEI-TMC-25, REF 5에 상세히 설명 합성 및 특성)을 크게, 트랜 스펙 션 효율을 향상 양이온으로부터 세포 독성을 줄여따라서 막 중단 및 실험 비용을 절감 할 수 있습니다. 또한, 세포 생존 및 단백질 발현이 크게 포도당과 비타민 공급 배양 보조제의 첨가로 향상된다. 중요한 kifunensine와 당화 단백질, 치료의 제조, 만노 I의 비 독성 화학 억제제, 대신에 단일 N 아세틸 글루코사민으로 단백질을 수득 엔도 글리코시다 제의 EndoHf에 의해 제거 될 수있다 정의 미성숙 글리 칸으로 단백질을 생산 전체 길이가 6 글리 칸을 N- 결합. 마지막으로, 혈청, 화학적 매체에 단백질의 분비는 구조적, 생화학 적 연구에 대한 신속하고 손쉬운 정화를 할 수 있습니다. 단일 단계 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA 니켈) 수지의 정제는 경우에 따라, 결정화를 위해 충분한 순도의 단백질을 얻을 수 있고, 상징액의 종 및 오염의 대부분을 제거한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F 세포는 번역 후 변형을 필요로하는 단백질의 강력한 생산을 제공한다. 이 시스템은 이황화물, 당화, 그렇지 않으면 더 일상적인 표현 도구를 사용하여 결석 것 인산화를 포함 기본적으로 접힌 단백질의 신속하고 확장 가능한 표현을 할 수 있습니다. 또한,이 시스템은 단순히 여러 플라스미드의 공동 형질 감염에 의해 발현 및 다중 단백질 복합체의 정제를 위해 사용될 수있다. TREM2 외에도,?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Riferimenti
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
