Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
La comprensión de la estructura de proteínas a nivel atómico es clave para descubrir las bases moleculares de las vías biológicas y enfermedades. Cristalografía de rayos X de proteínas es más utilizado el método / aplicable para la determinación de estructuras macromoleculares. El principal reto de este método es la obtención de cantidades suficientes de correctamente plegada, proteína pura. Esto se convierte en un problema particular cuando se trabaja con proteínas de mamífero secretada, que experimentan modificaciones post-traduccionales específicas.
Las proteínas expresadas en bacterias son la principal fuente de proteínas cristalizadas depositadas en el Protein Data Bank 1. Sistemas de expresión bacterianos se prefieren en gran parte porque son rápidos, de bajo costo y típicamente producen altos rendimientos de proteína. Sin embargo, los dominios extracelulares de proteínas de mamífero expresadas en bacterias a menudo no están correctamente plegadas, en la que se requieren pasos caso de replegamiento y purificación extensa para obtener homogéneamente foproteína LDED. Además, muchas proteínas de mamíferos requieren glicosilación postraduccional para lograr plegamiento apropiado 2. Aunque la expresión y la glicosilación en células de levadura o de insectos pueden superar el problema de plegado, modificaciones post-traduccionales, incluyendo glicosilación, difieren significativamente de los de células de mamífero 3, produciendo proteínas con modificaciones incorrectas o no homogéneos.
Las células de mamíferos expresan toda la maquinaria molecular necesaria para garantizar modificaciones post-traduccionales adecuadas y plegado; sin embargo, estos sistemas de expresión no son típicamente preferidas por la mayoría de los laboratorios, debido a los rendimientos limitados y altos costos de reactivos y consumibles. Polietilenimina (PEI), un reactivo de transfección estándar es relativamente barato, pero impone considerable la citotoxicidad y la baja eficiencia de la transfección, lo que resulta en aumento de los costos en los medios de comunicación celular, el ADN, y el equipo de cultivo. Muchas alternativas a PEI son prohibitivamente caros. Abordamosestos problemas mediante la descripción de una combinación de herramientas mejoradas de cultivo de células y químicamente modificado PEI para el método rápido y relativamente barato para la expresión de proteínas de mamíferos secretadas, seguido de purificación de un solo paso. Este método robusto da rendimientos suficientes para estudios funcionales y bioquímicos 4, y en algunos casos, da lugar a la proteína susceptible a la cristalización sin purificación adicional.
Este protocolo describe varias técnicas para maximizar la expresión y el rendimiento de las proteínas de mamíferos secretadas en el riñón embrionario humano (HEK) 293F células cultivadas en suspensión. La eficacia de transfección (y costo), la producción y purificación de proteínas están enormemente mejorado siguiendo este protocolo. PEI modificado por la adición de carbamatos a través de una reacción de apertura de anillo de un solo paso (PEI-TMC-25, síntesis y propiedades se describe en detalle en la ref 5) mejora en gran medida la eficiencia de transfección, reduce la citotoxicidad de catiónicodisrupción de la membrana y por consiguiente reduce los costes de experimentación. Por otra parte, la viabilidad celular y la expresión de proteínas se mejoran en gran medida con la adición de suplementos de cultivo para el suministro de glucosa y vitaminas. Es importante destacar que para la producción de proteínas glicosiladas, el tratamiento con kifunensine, un inhibidor químico no tóxico de manosidasa I, produce proteínas con definidos, glicanos inmaduras, que pueden ser eliminados por el EndoHf endoglicosidasa para producir proteínas con un solo N-acetilglucosamina en lugar de un álbum de glicanos 6 N-ligado. Finalmente, la secreción de proteínas en un, medio químicamente definido libre de suero permite la purificación rápida y fácil para estudios estructurales y bioquímicos. Níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) de purificación de resina Single-step elimina la mayoría de las especies contaminantes en el sobrenadante y, en algunos casos, puede producir la proteína de pureza suficiente para la cristalización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células HEK 293F ofrecen la producción de robusta de las proteínas que requieren modificaciones posteriores a la traducción. Este sistema permite la expresión rápida y escalable de las proteínas plegadas de forma nativa que contienen disulfuros, glicosilación, fosforilación y que de otra manera estaría ausente el uso de herramientas de expresión más rutinarias. Además, este sistema puede ser utilizado para la expresión y purificación de varios complejos de proteínas simplemente mediante la co-transfecci?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Riferimenti
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