Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Das Verständnis von Proteinstrukturen auf atomarer Ebene ist der Schlüssel zur Aufdeckung der molekularen Grundlagen der biologischen Wege und Krankheiten. Röntgen Proteinkristallographie ist das am häufigsten verwendete / anwendbares Verfahren zur Bestimmung von hochmolekularen Strukturen. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist, ausreichende Mengen an korrekt gefalteten, reines Protein. Dies wird ein Problem besonders bei der Arbeit mit sezerniertes Säugerproteinen, die bestimmte post-translationale Modifikationen unterzogen werden.
Bakteriell exprimierten Proteine sind die Hauptquelle für kristallisierte Proteine in der Proteindatenbank 1 abgeschieden. Bakterielle Expressionssysteme sind weitgehend bevorzugt, da sie schnell, kostengünstig und erzeugen typischerweise hohe Ausbeuten an Protein. Jedoch extrazellulären Domänen von Säugerproteinen in Bakterien exprimiert werden oftmals nicht richtig gefaltet sind, zum Erhalten homogen fo in welchem Fall die Rückfaltung und aufwendige Reinigungsschritte erforderlich sindlded Protein. Darüber hinaus haben viele Säugetierproteinen erfordern posttranslationale Glykosylierung, um die richtige Faltung 2 zu erzielen. Obwohl die Expression und Glycosylierung in Hefe oder Insektenzellen können die Falte Problem zu überwinden, post-translationale Modifikationen einschließlich Glykosylierung, unterscheiden sich erheblich von denen von Säugetierzellen 3, wodurch Proteine, die mit fehlerhaften oder nicht homogenen Modifikationen.
Säugerzellen alle erforderlichen molekularen Maschinerie zum richtigen post-translationalen Modifikationen und Faltung zu gewährleisten; aber diese Expressionssysteme sind in der Regel nicht von den meisten Labors bevorzugt, aufgrund der begrenzten Ausbeuten und hohen Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Polyethylenimin (PEI), ist ein Standard-Transfektionsreagenz relativ billig, aber erlegt beträchtliche Zytotoxizität und niedrige Transfektionseffizienz, was zu erhöhten Kosten in Zellmedien, DNA, und Kultivieren Ausrüstung. Viele Alternativen zu PEI sind unerschwinglich teuer. Wir sprechenDiese Probleme mit der Beschreibung einer Kombination von verbesserten Zellkulturwerkzeuge und chemisch modifizierte PEI für die schnelle und relativ kostengünstige Methode für die Expression von sezernierten Säugetierproteinen, gefolgt von der Einzelschritt-Reinigung. Das robuste Verfahren ergibt ausreichende Ausbeuten zur funktionellen und biochemischen Untersuchungen 4 und in einigen Fällen führt Protein zugänglich, um die Kristallisation ohne weitere Reinigung.
Dieses Protokoll beschreibt verschiedene Techniken, um die Expression zu maximieren und die Ausbeute für sezernierte Säugetierproteinen in humanen embryonalen Nieren (HEK) 293F Zellen in Suspension gezüchtet. Transfektionseffizienz (und Kosten), Protein-Produktion und Reinigung sind alle stark von folgenden dieses Protokoll erweitert. PEI durch Zugabe von Carbamaten durch eine Einzelschritt-Ringöffnungsreaktion modifiziert (PEI-TMC-25 Synthese und Eigenschaften im Detail in Lit. 5 beschrieben) verbessert Transfektionseffizienz, verringert die Zytotoxizität von kationischenMembranzerstörung und entsprechend reduziert Experiment Kosten. Weiterhin werden die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proteinexpression stark mit der Zugabe der Kultur Ergänzungen Glucose und Vitamine zuzuführen verbessert. Wichtig ist für die Herstellung von glycosylierten Proteinen, Behandlung mit kifunensine, eine ungiftige chemische Inhibitor von Mannosidase I, produziert Proteine mit definierten, unreife Glycane, die durch die Endoglycosidase EndoHf entfernt werden, um Proteine mit einer einzelnen N-Acetylglucosamin anstelle von zu ergeben ein voller Länge N-gebundene Glycan 6. Schließlich wird die Sekretion von Proteinen in einem serumfreien, chemisch definierten Medium ermöglicht eine schnelle und leichte Reinigung für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Einzelschritt-Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA-Harz) Reinigung entfernt die meisten verunreinigenden Spezies im Überstand und in einigen Fällen kann Protein mit ausreichender Reinheit für eine Kristallisation ergeben.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F-Zellen bieten robuste Produktion von Proteinen erfordert post-translationale Modifikationen. Dieses System ermöglicht eine schnelle und skalierbare Ausdruck der nativ gefalteten Proteine enthalten, Disulfide, Glykosylierung und Phosphorylierung, die sonst mit mehr Routine Expression Tools abwesend sein würde. Darüber hinaus kann dieses System für die Expression und Reinigung von Multiproteinkomplexen einfach durch Co-Transfektion von mehreren Plasmiden verwendet werden. Neben TREM2 Dieses System wurde…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
Riferimenti
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