نموذج الفأر ليزر بفعل اتساع الأوعية الدموية المشيمية
Summary
Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.
Abstract
The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.
Introduction
الضمور البقعي (AMD) المرتبطة بالعمر هو واحد من الأسباب الرئيسية للعمى في الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 50 1-3. AMD يمكن تصنيفها إلى نوعين: ضامر ("تجف") AMD وحديث التوعي ("الرطب") AMD. يتميز السابق بضمور الجغرافي للالظهارة الصبغية الشبكية (RPE)، المشيماء الشعيرية، وخلايا مستقبلة للضوء، في حين يتميز هذا الأخير من غزو السفن غير طبيعية من المشيمية في طبقات الشبكية الخارجي مما تسبب في تسرب، والنزف، والتليف، وفي نهاية المطاف مما يؤدي إلى العمى 1،2. من الشكلين، وحسابات التوعية المستحدثة AMD بالنسبة للغالبية من فقدان البصر 1. لحسن الحظ، هذا النموذج لديه خيارات عديدة للإدارة الدوائية الفعالة، في حين أن نظيرتها الضموري قد حاليا أي ثبت العلاجات الطبية 3. وعلاوة على ذلك، لأن النموذج التوعية المستحدثة تم بسهولة إعادة استسلمت في نموذج حيواني، فقد كان أكثر سهولة على نطاق واسع والأساسيةبحث MD استكشاف الآليات المرضية الكامنة من أجل تطوير علاجات رواية (4).
تم تطوير نموذج حيواني الأول من اتساع الأوعية الدموية المشيمية التجريبية (CNV) عن طريق ريان وآخرون. في الرئيسيات غير البشرية 5. هذه القطيعة نموذج الناجم عن غشاء بروك عبر الضوئي بالليزر، مما تسبب في الاستجابة الالتهابية المحلية مما أدى إلى تكوين الأوعية الدموية شبيهة بتلك التي شوهدت في التوعية المستحدثة AMD. تم العثور على تطور الأنسجة من الأوعية الدموية تحريض ما بعد الليزر لتقليد حديث التوعي AMD، التي أكدت صحة النموذج 6. الرئيسيات غير البشرية تقدم علم التشريح الأكثر مماثلة على البشر، ولكن للأسف، هي مكلفة للحفاظ على، لا يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا، ولها دوام بطء تطور المرض 7. على النقيض من نماذج القوارض هي أكثر من ذلك بكثير للحفاظ على فعالية من حيث التكلفة، ويمكن التلاعب بها وراثيا مع السهولة النسبية، ولها أسرع بكثير فصول التوجيه الجامعيRSE من تطور المرض (ويمكن إجراء التجارب على نطاق ووقت أسابيع مقابل شهرا). وينبغي إجراء هذه التجارب إلا في القوارض المصطبغة كما أنه من الصعب جدا تصور في الحيوانات البيضاء.
نموذج CNV يسببها الليزر الفأر، وضعت لأول مرة من قبل مجموعة Campochiaro في أواخر 90 10 و، نمت لتكون النموذج الحيواني السائد في معظم الدراسات الحديثة 11-16. بسبب المرضية المعقدة ويزال من غير الواضح من CNV، وقد تم تطبيق نموذج الليزر في جميع جوانب البحث AMD الرطب بدءا من دراسة الآليات الجزيئية القيادة الأوعية الدموية لتقييم طرق العلاج الجديدة للاستخدام البشري في المستقبل. على سبيل المثال، ساكوراي وآخرون. واسبينوزا-Heidmann وآخرون. استخدام نموذج الليزر لدراسة تأثير الضامة على تطوير CNV باستخدام الفئران المعدلة وراثيا والعلاجات الدوائية نضوب 15، 16. Giani وآخرون. وHoerster وآخرون. تستخدم البصرية تماسك التصوير المقطعي (أكتوبر) لصورة CNV في محاولة لتوصيف تطور CNV ومقارنة النتائج النسيجية لنتائج نشاهد في أكتوبر التصوير 12،17 الليزر التي يسببها. وأخيرا، وقد استخدمت الدراسات التي تنطوي على حقن intravitreal من العوامل المضادة للعائية كما شرطان أساسيان للمحاكمات الإنسان وكانت حيوية في تطوير الجيل الأول من مضادات VEGF المستخدمة في إدارة حديث التوعي AMD اليوم 10،18،19.
نماذج بديلة لالتجريبي CNV تستخدم الأساليب الجراحية للحث على CNV. ويشمل هذا الإجراء حقن المواد المؤيدة للعائية (مثل ناقلات فيروسية المؤتلف overexpressing VEGF، حقن تحت الشبكية من خلايا RPE و / أو الخرز البوليسترين) لتقليد زيادة التعبير VEGF ينظر في التوعية المستحدثة AMD، وذلك بهدف التسبب في الأوعية الدموية 8،20. ومع ذلك، وهذه الطريقة تعطي معدلات أقل بشكل كبير من اتساع الأوعية الدموية. وأظهرت هذه الدراسات أن CNV فييحدث C57 / BL6 الفئران في 31٪ من عمليات الحقن مقابل ~ نسبة النجاح 70٪ يرى في طريقة الضوئي ليزر في نفس سلالة من الفئران 8،14. لهذه الأسباب، ونظرا للمزايا استخدام القوارض مقابل الرئيسيات غير البشرية، أصبح نموذج الفأر التي يسببها الليزر CNV النموذج الحيواني القياسي لCNV لمعظم حديث التوعي تجارب الدراسة AMD 8.
العين الماوس هي ضئيلة، الأنسجة الحساسة للعمل مع. المناورة من العين لتصور شبكية العين صعبة وتتطلب قدرا كبيرا من التدريب حتى يتم تحقيق إتقان. ويزيد من تعقيد هذه المهمة من حقيقة أنه يجب أن يتعلمها مع اليد المسيطرة وغير المسيطرة. وعلاوة على ذلك، بعد أن تم تعلم حركات غرامة المطلوبة لتصور شبكية العين، والتنسيق بين كلتا اليدين ودواسة القدم تشغيل الليزر مهمة. في هذه الورقة، سعينا لاستخلاص تحديات تعلم كل من التلاعب المادية تشارك في الليزر التي يسببها CNV بروكedure إلى دليل من شأنه أن يساعد مشغلي تحقيق النجاح السريع مع هذا النموذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عوامل متعددة يمكن أن تؤثر على تسليم الليزر والناتجة عن تطوير الآفة CNV بعد نجاح الليزر الاستقراء. يجب السيطرة على هذه العوامل لوموحدة من أجل الحصول على النتائج الأكثر موثوقية. والأكثر أهمية من هذه العوامل هي اختيار الماوس (النمط الجيني والعمر والجنس)، واختيار مخد…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.
Materials
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 gauge insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
Riferimenti
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-Related Macular Degeneration. NEJM. 358, 2606-2617 (2008).
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
