Een muismodel voor Laser-geïnduceerde Choroïdale Neovascularisatie

Summary

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Abstract

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.

First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.

The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.

Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Introduction

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is één van de belangrijkste oorzaken van blindheid bij mensen boven de leeftijd van 50 ^3/1. AMD kunnen worden ingedeeld in twee vormen: atrofische ("droog") AMD en neovasculaire ("natte") AMD. Het eerste wordt gekenmerkt door geografische atrofie van het retinale pigmentepitheel (RPE), choriocapillaris en fotoreceptoren, terwijl de laatste wordt gekenmerkt door invasie van abnormale vaartuigen uit de choroidea in de buitenste retina lagen zo lekkage, bloedingen en fibrose, en uiteindelijk leidt tot blindheid ^1,2. Van de twee vormen, neovasculaire AMD verantwoordelijk voor de meerderheid van gezichtsverlies ^1. Gelukkig is deze vorm heeft tal van effectieve farmacologische opties voor het beheer, terwijl zijn atrofische tegenhanger momenteel geen bewezen medische behandelingen ^3. Omdat bovendien de neovasculaire vorm is gemakkelijk opnieuw overgegeven in een diermodel maar het is breder toegankelijk fundamentele A geweestMD onderzoek verkennen van de onderliggende pathologische mechanismen om nieuwe therapieën te ontwikkelen ^4.

Het eerste diermodel voor experimentele choroïdale neovascularisatie (CNV) werd ontwikkeld door Ryan et al. bij niet-humane primaten ^5. Dit model veroorzaakte breuk van Bruch's membraan via laserfotocoagulatie, die een lokale ontstekingsreactie resulteert in angiogenese vergelijkbaar met dat in neovasculaire AMD veroorzaakt. De histopathologische progressie van angiogenese post-laser inductie werd gevonden na te bootsen neovasculaire AMD, waarvan het model geldigheid ⁶ bevestigd. Niet-menselijke primaten de meest vergelijkbaar anatomie mens, maar helaas zijn duur om te onderhouden, kan niet gemakkelijk worden genetisch gemanipuleerd en een trage tijdsverloop van ziekteprogressie ^7. Daartegenover, knaagdiermodellen veel rendabeler te onderhouden, kan genetisch worden gemanipuleerd met relatief gemak en een veel snellere course ziekteprogressie (experimenten kunnen worden uitgevoerd op een tijdschaal van weken versus maanden). Deze experimenten moeten alleen worden uitgevoerd gepigmenteerde knaagdieren het zeer moeilijk te visualiseren in albinodieren.

De muis laser-geïnduceerd CNV model eerst ontwikkeld door de Campochiaro groep in de late 90's ^10, is uitgegroeid tot het dominante diermodel in de meeste recente studies ^16/11 zijn. Vanwege de complexe en onduidelijk pathogenese van CNV, heeft de laser model toegepast in alle aspecten van natte AMD onderzoek gaande van het bestuderen van de moleculaire mechanismen die angiogenese te evalueren nieuwe behandelingsmogelijkheden voor toekomstig menselijk gebruik. Bijvoorbeeld, Sakurai et al. en Espinosa-Heidmann et al. de laser model gebruikt om het effect van macrofagen op de ontwikkeling van CNV in transgene muizen en farmacologische vermindering behandelingen ^{15, 16} onderzocht. Giani et al. en Hoerster c.s.. gebruikte optische coherentie tomografie (OCT) naar het beeld-laser geïnduceerde CNV in een poging om de progressie van CNV karakteriseren en vergelijken de histopathologische bevindingen aan de bevindingen zien op oktober imaging ^12,17. Tenslotte hebben studies met intravitreale injectie van anti-angiogene middelen gebruikt als eerste vereisten voor menselijke proeven en waren essentieel bij het ​​ontwikkelen van de eerste generatie anti-VEGF stoffen voor beheer van neovasculaire AMD vandaag ^10,18,19.

Alternatieve modellen voor experimentele CNV gebruik chirurgische methoden CNV induceren. Deze werkwijze omvat het injecteren van pro-angiogene substanties (bijv recombinante virale vectoren overexpressie VEGF, subretinale injectie van RPE cellen en / of polystyreen korrels) de toegenomen VEGF-expressie waargenomen bij neovasculaire AMD nabootsen, met als doel het veroorzaken angiogenese ^8,20. Echter, levert deze werkwijze een aanzienlijk lagere incidentie van neovascularisatie; Deze studies toonden aan dat CNV inC57 / BL6 muizen voorkomt in 31% van injecties versus ~ 70% slagingspercentage gezien in de laser fotocoagulatie werkwijze van dezelfde stam van muizen ^8,14. Om deze redenen, en gezien de voordelen van knaagdieren versus niet-humane primaten, is het muizenmodel van door laser geïnduceerde CNV worden standaard diermodel van CNV meeste neovasculaire AMD studie experimenten ^8.

De muis oog is een minuscuul, delicate weefsel te werken. Manoeuvreren van het oog naar de retina te visualiseren is moeilijk en vereist veel oefening tot beheersing wordt bereikt. Deze taak wordt bemoeilijkt door het feit dat het moet worden geleerd de dominante en niet-dominante hand. Bovendien, na de fijne bewegingen die nodig zijn om het netvlies te visualiseren zijn geleerd, de coördinatie tussen beide handen en het voetpedaal bedienen van de laser zijn belangrijk. In dit artikel hebben we geprobeerd om de uitdagingen van het leren van alle fysieke manipulaties die betrokken zijn bij de laser-geïnduceerde CNV proc destillerenedure in een gids die zou helpen exploitanten bereiken snelle succes met dit model.

Protocol

Alle dieren worden behandeld in overeenstemming met de gids van de Zorg en gebruik van proefdieren 2013 Edition, de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en zoals goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en gebruik Comite voor de Northwestern University. Opmerking: De volgende procedure kan volledig worden uitgevoerd met één operator; het is echter veel efficiënter uitgevoerd met twee op…

Representative Results

Kwantificering van CNV laesies kunnen worden uitgevoerd door middel van analyse van de flat-gemonteerde choroidea met immunofluorescentiekleuring aan de CNV schepen labelen. De twee meest gebruikte methoden van weefsel voorbereiding zijn FITC-dextran labeling, gedaan via perfusie onmiddellijk voor het offeren van dieren, of post-mortem immuno-kleuring met een endotheelcellen marker. Beide werkwijzen zijn eerder in detail beschreven 13,14,21; Figuren 1 en 2 tonen voorbeelden v…

Discussion

Er zijn meerdere factoren die van invloed kan zijn laser levering en de daaruit voortvloeiende CNV laesie ontwikkeling na een succesvolle laser-inductie. Deze factoren moeten worden gecontroleerd en gestandaardiseerd teneinde de meest betrouwbare resultaten. De meeste relevante factoren muis selectie (genotype, leeftijd en geslacht), verdoving selectie en laserinstellingen.

De specifieke muismodel gebruikt kan een significant effect op het verloop van de CNV ontwikkeling. De meest gebruikte …

Materials

532 nm (green) argon ophthalmic laser	IRIDEX	GLx	any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used
slit lamp	Carl Zeiss	30SL-M	any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser
tribromoethanol	Sigma	T48402-25G	used to make anesthetic
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L	used to make anesthetic
amber glass vials + septa	Wheaton	WH-223696	tribromoethanol storage
tissue wipes	VWR	82003-820	miscellaneous
1% tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	pupillary dilation
0.5% tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	topical anesthesia
artificial tears	Alcon	58768-788-25	hydration
heat therapy pump (for animal warming)	Kent Scientific	HTP-1500	used to maintain animal body temp
warming pad	Kent Scientific	TPZ-0510EA	maintains animal body temperature
30 gauge insulin needles	BD	328418	IP anesthesia injection
scale	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	mouse weighing
cover slip (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	flatten cornea to visualize mouse retina
xylazine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
ketamine	obtained from institution	obtained from institution	anesthesia
Volocity	PerkinElmer		used for volumetric re-construction
ImageJ	National Institutes of Health		used for image analysis