Lazer kaynaklı Koroid Neovaskülarizasyonlarında A Fare Modeli
Summary
Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.
Abstract
The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch’s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD.
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects.
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.
Introduction
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) 50 1-3 yaş üstü bireylerde körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. AMD iki formda sınıflandırılabilir: atrofik ("kurutmak") AMD ve neovasküler ("ıslak") AMD. Eski ikinci sızıntı, kanama ve fibrozis neden dış retina katmanlarının içine koroid anormal damarların işgali ile karakterize edilirken, retina pigment epiteli (RPE), koriokapillaris ve fotoreseptör coğrafi atrofi ile karakterize ve sonuçta bir körlük 1,2 yol açar. İki formları, neovasküler AMD görme kaybı 1 çoğunluğu oluşturuyor. Onun atrofik muadili şu anda hiçbir tıbbi tedaviler 3 kanıtlamıştır oysa Neyse ki, bu form sayısız etkili farmakolojik tedavi seçenekleri vardır. Neovasküler formu kolaylıkla bir hayvan modelinde yeniden teslim oldu edilmiştir çünkü Ayrıca, temel A'ya daha yaygın olarak erişilebilir olmuşturYeni tedaviler 4 geliştirmek için altta yatan patolojik mekanizmaların keşfetmek MD araştırma.
Deneysel koroid neovaskülarizasyon (KNV) ilk hayvan modeli Ryan ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. insan olmayan primatlar 5. Neovasküler AMD görülene benzer anjiyojenez ile sonuçlanan bir lokal enflamatuar bir yanıt neden olduğu lazer fotokoagülasyon ile Bruch zarının Bu model bağlı kopma. Anjiyogenez sonrası lazer indüksiyon histopatolojik ilerleme modelinin geçerliliğini 6 doğruladı neovasküler AMD, taklit bulunmuştur. Insan olmayan primatlar insanlara en çok benzeyen anatomi sunuyoruz, ama ne yazık ki, kolayca genetik manipüle edilemez, bakımı pahalı ve hastalığın ilerlemesi 7 yavaş bir zaman kursumuz var. Buna karşın bir, kemirgen modelleri çok daha düşük maliyetli sürdürmek, genetik göreli kolaylıkla manipüle edilebilir, ve cou hızlı bir çok şey varhastalık ilerlemesinin rse (deney ay karşısında haftalık bir zaman ölçeğinde yapılabilir). Bu albino hayvanlarda görselleştirmek için çok zor olduğu gibi bu deneyler sadece pigmentli kemirgenlerde yapılmalıdır.
İlk sonlarında 90 en 10 Campochiaro grubu tarafından geliştirilen fare lazer kaynaklı CNV modeli, son çalışmalar 11-16 çoğunda baskın bir hayvan modeli olarak büyümüştür. Nedeniyle CNV karmaşık ve hala belirsiz patogenez, lazer modeli gelecekte insan kullanımı için yeni tedavi modaliteleri değerlendirmek için anjiyogenez sürüş moleküler mekanizmaları inceleyerek kadar ıslak AMD araştırma tüm yönleriyle uygulanmıştır. Örneğin, Sakurai ve diğ. ve Espinoza-HEIDMANN ve diğ. transgenik fareler ve farmakolojik tükenme tedavileri 15, 16 kullanılarak KNV gelişimi üzerine makrofajlar etkisini araştırmak için lazer modeli kullanılır. Giani ve ark. ve Hoerster diğ. görüntüye kullanılan optik koherens tomografi (OCT) lazer kaynaklı KNV ilerlemesini karakterize ve Ekim görüntüleme 12,17 görülen bulgulara histopatolojik bulguları karşılaştırmak için bir çaba CNV. Son olarak, anti-anjiyogenik ajanlar intravitreal enjeksiyonunu içeren çalışmalar insan denemeleri için ön koşul olarak kullanılan ve neovasküler AMD 10,18,19 yönetiminde kullanılan anti-VEGF ajanların ilk nesil gelişmekte hayati önem oylandı.
Deneysel CNV için alternatif modeller KNV ikna etmek için cerrahi yöntemler kullanmaktadır. Bu prosedür, pro-anjiyojenik maddeler enjekte içerir (VEGF aşırı eksprese eden örneğin, rekombinant viral vektörler, RPE hücreleri ve / veya polistiren boncuklar subretinal enjeksiyon) anjiyojenezi 8,20 neden amacıyla, neovasküler AMD görülen artış olarak VEGF ifadesini taklit etmek. Bununla birlikte, bu yöntem, neovaskülarizasyonun büyük ölçüde düşük bir oranda verir; Bu çalışmalar, bu KNV gösterdiC57 / BL6 fareleri iki ayrı fare 8,14 aynı gerginlik lazer fotokoagülasyon yönteminde görülen ~% 70 başarı oranı karşı enjeksiyonlar 31% 'unda görülür. Bu nedenlerden dolayı, ve insan olmayan primatlar karşı kemirgenler kullanmanın avantajları göz önüne alındığında, lazer kaynaklı KNV'ların fare modeli en neovasküler AMD çalışma deneyleri 8 KNV'nin standart hayvan modeli haline gelmiştir.
Fare gözü ile çalışmak için bir minik, narin bir dokudur. Retina görselleştirmek için göz Manevra zordur ve ustalık elde edilene kadar çok pratik gerektirir. Bu görev hakim ve baskın olmayan el ile öğrenmiş olmalıdır gerçeği ile karmaşık. Retina görselleştirmek için gerekli ince hareketleri öğrenmiş edildikten sonra Dahası, her iki el ve lazer işletim ayak pedalı arasındaki koordinasyon önemlidir. Bu yazıda, lazer kaynaklı KNV yordam katılan fiziksel manipülasyonlar tüm öğrenme zorlukları damıtmak çalıştıoperatörler bu model ile hızlı bir başarı elde yardımcı olacak bir rehber haline edure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı lazer indüksiyon sonrası lazer teslimat ve sonuçtaki KNV lezyon gelişimini etkileyen birden fazla faktör vardır. Bu faktörler kontrollü ve en güvenilir sonuçlar elde etmek için standardize edilmelidir. Bu faktörlerin en uygun fare seçimi (genotipi, yaş, cinsiyet ve), anestezik seçimi, ve lazer ayarları vardır.
Kullanılan özel fare modeli KNV gelişme seyri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. En yaygın olarak kullanılan genotip C57BL / 6 faredir. Hayv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.
Materials
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 gauge insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
Riferimenti
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-Related Macular Degeneration. NEJM. 358, 2606-2617 (2008).
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
