Introduction
Des éléments de régulation transcriptionnelle sont critiques pour réglage fin spatio-temporelle de l' expression des gènes au cours du développement 1 et la modification de ces éléments peut entraîner une maladie due à l' expression génique aberrante 2. De nombreuses régions associées à des maladies identifiées par le génome des études d'association sont larges dans les régions non codantes et présentent des caractéristiques d'amplificateurs de transcription 3-4. L' identification des amplificateurs et les harmoniser avec les gènes qu'ils régulent est compliqué car ils sont souvent situés à plusieurs kilobases à l' écart des gènes qu'ils régulent et peuvent être activées d'une manière spécifique au tissu 5-6. Prévisions Enhancer sont généralement basées sur des marques de modification des histones, des complexes de médiateur-cohesin et la liaison de la cellule transcription spécifique de type facteurs 7-10. La validation des amplificateurs de prédits est le plus souvent réalisé par un dosage à base de vecteur dans lequel l'activateur active l' expression d'un gène rapporteur 11-12. Ces données fournissent vinformations ressources précieuses sur le potentiel de régulation des séquences amplificatrices putatives, mais ne révèlent pas leur fonction dans leur contexte génomique endogène ou d'identifier les gènes qu'ils régulent. édition du génome est un outil puissant pour étudier la fonction des éléments de régulation transcriptionnelle dans leur contexte endogène par l'analyse de perte de fonction.
Les progrès récents dans l'édition du génome, à savoir le / cas9 système de montage du génome CRISPR, faciliter l'enquête de la fonction du génome. Le système / cas9 CRISPR est facile à utiliser et adaptable à de nombreux systèmes biologiques. La protéine cas9 est ciblé à un site spécifique par une ARN de guidage (ARNg) 13 dans le génome. Le complexe SpCas9 / gARN analyse du génome pour sa séquence génomique cible qui doit être 5 'à une séquence protospacer motif adjacent (PAM), NGG 14-15. Appariement de bases de l'ARNg à sa cible, un 20 nucleotides (nt) la séquence complémentaire de l'ARNg, active une activité nuclease SpCas9 résultant en un doublpause e brin (DSB) de 3 pb en amont de la séquence PAM. La spécificité est obtenue par appariement complet de la base dans la région de la graine gARN, le 12.06 nt adjacent à l'APM; à l' inverse, mal assortit 5 'de la graine sont généralement tolérés 16-17. L'ORD a introduit peut être réparé soit par l'extrémité non homologue de jonction (NHEJ) réparation de l'ADN ou d'homologie de réparation dirigée (HDR) mechanisms.NHEJ réparation de l'ADN crée souvent insertion / délétion (indels) de quelques pb au niveau du site cible qui peut perturber le cadre ouvert de lecture (ORF) d'un gène. Pour générer de plus grandes deletions dans le génome de deux ARNg, qui flanquent la région d'intérêt, peuvent être utilisés 18 à 19. Cette approche est particulièrement utile pour l'étude des amplificateurs de transcription regroupés en régions de contrôle de locus ou super-amplificateurs qui sont plus grands que des amplificateurs conventionnels 9,18,20-22.
Suppressions monoallélique sont un modèle précieux pour l' étude cis - régulation de la transcription. Le chang observée au niveau de la transcription après la suppression monoallélique d'un activateur est en corrélation avec le rôle de cet activateur dans la régulation des gènes sans les effets de confusion qui peuvent se produire lorsque la transcription des deux allèles est affecté potentiellement influencer remise en forme cellulaire. L'évaluation de l'expression réduite est difficile sans toutefois la capacité de distinguer la suppression de l'allèle de type sauvage. En outre, le génotypage délétions à chaque allèle sans la capacité de distinguer les deux allèles est difficile, surtout pour les grandes suppressions de> 10 kb à 1 Mb 23 , dans lequel il est difficile d'amplifier toute la région de type sauvage par PCR. L'utilisation de cellules ES F1 générées par croisement avec 129 Mus musculus Mus castaneus permet aux deux allèles d'être différenciés par PCR spécifique d'allèle 18,24. Le génome hybride dans ces cellules facilite le dépistage de la suppression spécifique de l'allèle et l'analyse d'expression. En moyenne, il y a un SNP tous les 125 pb entre ces deux génomes, Offrant une flexibilité dans la conception de l'amorce d'expression et de génotypage analyse. La présence d'un SNP peut influer sur la température d' amorce de fusion (Tm) et la spécificité de cible en temps réel par PCR quantitative (qPCR) d' amplification permettant une discrimination des deux allèles 25. En outre , un mésappariement à l'intérieur de l' extrémité 3 'de l'amorce influence grandement la capacité de l' ADN polymérase pour s'étendre à partir de l'amorce empêchant l' amplification de l'allèle cible indésirable 26. Décrite dans le protocole suivant est l'utilisation de cellules ES F1 pour allèle spécifique enhancer suppressions de plus de 1 kb et analyse de l' expression suivante en utilisant le / cas9 système de montage du génome CRISPR (figure 1).
Figure 1. suppression Enhancer utilisant CRISPR / cas9 pour étudier cis -regulation de l' expression génique. (A) Les cellules ES F1 générées par un croisement entre Mus musculus 129 et Mus castaneus sont utilisés pour permettre la suppression allèle spécifique. (B) Deux ARN de guidage (ARNg) sont utilisés pour induire une grande deletion à médiation par cas9 de la région amplificatrice. (C) Les amorces sont utilisées pour identifier les grandes mono- et délétions bi-alléliques. Les amorces orange sont les amorces à l'intérieur, les amorces violet sont les amorces externes et les amorces vertes sont les amorces flanquant gARN. (D) Les changements dans l' expression des gènes sont surveillés à l' aide spécifique d'allèle qPCR. RFU désigne des unités de fluorescence relative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Concevoir et construire l'gARN
- Pour supprimer les régions activatrices transcriptionnelles utilisent deux ARNg, une 5 'et une 3' de la région d'intérêt. Utilisez la piste de UCSC de la souris du navigateur du génome généré par le laboratoire Zhang pour identifier des séquences uniques gARN (http://www.genome-engineering.org 15). Vérifiez ensuite ces ARNg et leur PAM adjacent pour les SNP et indels en utilisant des outils en ligne fournis par l'Institut Sanger (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. Pour cibler les deux allèles avec une efficacité égale, éviter gARN séquences / PAM qui contiennent un SNP ou indel.
- Tout en choisissant le gARN, vérifier la faisabilité de concevoir des amorces spécifiques d'allèles pour le génotypage la suppression. Reportez-vous à la section 5 pour la conception d'amorce allèle spécifique.
- Assembler les deux plasmides gARN basés sur le protocole décrit au Mali et al. 2013 15. Incorporer le 20 pb séquence cible int uniques sélectionnéeo les oligonucléotides 61mer comme indiqué dans le tableau 7 ( les séquences sont affichés dans le sens 5 'à 3', et les bases sont en gras la séquence cible de 20 pb , qui sont les compléments inverses de l'autre).
- Mélanger 10 ul de 10 uM gARN Primer_F et 10 pl de 10 pM Primer_R complémentaire dans un tube.
- Anneler les amorces par incubation du mélange d'amorce à 100 ° C pendant 5 min, puis refroidir à 1 ° C / s à 25 ° C. Pour cette étape, utiliser une machine PCR ou placer le tube dans l'eau bouillante et laisser refroidir à température ambiante.
- Pour le mélange amorce hybridée, ajouter le mélange réactionnel suivant et incuber à 72 ° C pendant 30 min pour étendre chaque amorce: 18,5 pi d'eau, 10 pl de tampon 5x HF, 1 pl de mM dNTP 10 mélanger et 0,5 pi de haut polymérase fidélité ADN.
- Exécuter 10 ul de fragment cible sur un gel d'agarose à 2% pour confirmer les fragments de 100 pb de guidage ont été produites.
- Linéariser le vecteur gARN (un cadeau de GeoEglise rge; Addgene plasmide # 41824) 15 avec Afl II en utilisant la réaction suivante : mise en place: 5 pi de gARN squelette du vecteur (2-4 pg), 5 pi de tampon 10x, 3 pi de Afl II (20 unités / ul) et 32 ul de l'eau. Incuber le mélange réactionnel pendant 3 heures à 37 ° C.
- Exécuter le produit de digestion sur un gel d'agarose à 1% et on purifie la bande d'ADN correspondant aux 3,5 kb gARN vecteur linéarisé en utilisant un kit d'extraction de gel en suivant les instructions du fabricant.
- Mettre en place des réactions d'assemblage Gibson 29-30 linéarisé en utilisant vecteur gARN et le fragment de l' étape 1.2.3 cible comme suit: 1 pl de vecteur linéaire gARN (50 ng / pl), 1 pl de fragment cible, 10 pl de 2x Gibson ensemble master mix et 8 pi d'eau. Incuber réactions à 50 ° C pendant 60 min.
- Transformation de cellules de E. coli avec assemblé gARN Vector.
- Mélanger 1 pl du vecteur gARN assemblé à partir de 1.2.7et 50 ul de DH5a (souche E. coli) des cellules dans un tube. Transformer les cellules DH5a par la méthode du choc thermique en exposant les cellules à 42 ° C pendant 45 secondes.
- Snap refroidir les tubes sur de la glace pendant 5 min; puis ajouter 400 ul de milieu SOC et incuber à 37 ° C pendant 45 min dans un incubateur à agitation.
- Étaler 100 pi des cellules DH5a sur un LB-kanamycine (50 pg / ml) plaque pour la sélection positive des cellules transformées et incuber O / N à 37 ° C.
- Dépistage positif E. coli Colonies pour gARN Insérer.
- Choisir une colonie résistante à la kanamycine et à remettre en suspension dans 3 ml de LB contenant 50 ug / ml de kanamycine. Répétez la même pour 6-8 colonies et incuber tous les tubes à 37 ° CO / N dans un incubateur à agitation.
- Extraire des plasmides de l'O / N adulte culture utilisant le plasmide mini kit de préparation en suivant le manuel du fabricant.
- Préparer un mélange de réaction de digestion EcoR I pour vérifier la séquence insert gARNdans le plasmide. Pour chaque échantillon, préparer le mélange de réaction comme suit: 2 ul de tampon enzymatique, 1 pl d'EcoR I, 15 ul d'eau. Aliquoter le mélange réactionnel dans 1,5 ml tubes et ajouter 2 pi de plasmide. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 2 heures.
- Exécuter le produit de digestion sur un gel d'agarose à 1,5%.
Remarque: Les échantillons avec insert affiche une taille de la bande de 475 pb qui est de 100 pb plus élevé que les clones sans inserts.
Note: Alternativement, les clones positifs peuvent être criblés par une colonie PCR utilisant SP6 (avant) et T7 (inverse) amorces (tableau 7) qui se lient à la séquence de vecteur pour donner un fragment de taille 642 pb en présence d'un gARN insert. L'approche PCR de colonie est avantageux quand il y a un site EcoR I de restriction dans la séquence gARN.
- Confirmer la séquence de l'gARN Insertion par séquençage de l'ADN en utilisant l'amorce T7.
2. transfection
Remarque:L'électroporation est une méthode efficace de transfection des plasmides dans des cellules ES. Le procédé décrit ici utilise la technologie microporateur de transfection.
- Cultiver des cellules ES F1 dans une capsule de gélatine enrobées 10 cm contenant 10 ml de milieu cellulaire ES (tableau 1) à 37 ° C / 5% de CO 2. Lorsque les cellules atteignent 85% de confluence supprimer les médias et ajouter 2 ml de trypsine. Incuber à 37 ° C dans l'incubateur à CO 2 pendant 5 min.
Remarque: les cellules ES F1 ont été obtenues à partir de Barbara Panning 24 et sont disponibles sur demande. - Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 ml de milieu par centrifugation (tableau 2). à plusieurs reprises Pipette pour détacher les cellules complètement.
- Collecter toutes les cellules dans un tube de 15 ml et un essorage à 300 xg pendant 5 min. Remettre en suspension dans 3 ml de PBS et compte les cellules en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
- Sédimenter 1 x 10 6 cellules ES dans un tube de 1,5 ml par centrifugation à 300 g pendant 5 minutes et remise en suspension dans 100 pi de R (resuspension) tampon fourni par le fabricant du kit.
- Ajouter 5 ug chacun de pCas9_GFP (un cadeau de Kiran Musunuru; Addgene plasmide # 44719) 31, 5 'et 3' plasmides gARN pour la suppression de la région cible et mélanger doucement avec une pipette pour éviter l'introduction de bulles.
- Utilisez la pointe de la pipette électronique pour aspirer 100 ul du mélange d'électroporation, en prenant soin d'éviter une bulle dans la pointe.
- Programmer le volts, la largeur et des impulsions pour l'électroporation. Pour les cellules ES F1, utilisez 1.400 V, 10 msec pour 3 impulsions.
- Alors que le électroporation est en cours d'exécution d'observer la pointe pour voir des éventuelles étincelles dans la solution. Une étincelle indique la présence d'une bulle d'air et va interférer avec la transfection.
- Éjecte les cellules ES transfectées dans une capsule en gélatine revêtues 10 cm contenant 10 ml de milieu cellulaire ES (tableau 1) et incuber à 37 ° C / 5% de CO 2.
3. FACS de tri des cellules transfectées
- Au bout de 48 h, détacher les cellules par addition de 2 ml de trypsine et on incube à 37 ° C dans l'incubateur à CO 2 pendant 5 min.
- Neutraliser la plaque par addition de 10 ml d' un tampon de collecte (tableau 3). Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml et un essorage à 300 xg pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de tri (tableau 4). Compter les cellules et dilué en fonction de la plate-forme de tri. Diluer les cellules à 0,5-1 x 10 6 cellules / ml pour le tri en tubes de 15 ml et pour trier des cellules individuelles directement dans des plaques à 96 puits, diluer les cellules à 2-5 x 10 6 cellules / ml.
- Trier les cellules cas9-GFP + ES en utilisant un flux FACS cytomètre 32. Recueillir les cellules en vrac dans des tubes avec 2 ml de milieu de récupération (tableau 5) et la plaque comme décrit dans 3.5 pour la cueillette des colonies, ou des cellules de tri individuels directement dans des plaques à 96 puits revêtues de gélatine contenant 100 pi de milieu de cellules ES / puits (
- Semences de 1 à 1,5 x 10 4 cellules GFP + cellules ES dans une capsule de gélatine enrobées 10 cm contenant 10 milieu de cellules ES ml (tableau 1). Placage à cette faible densité facilitera la cueillette des colonies de cellules ES individuelles.
4. Les clones en culture pour le génotypage, l'analyse d'expression et des stocks de cellules de congélation
- Au jour 4-5 après le tri, le score de chaque puits de plaques à 96 puits triés directement pour déterminer la présence de colonies de cellules ES.
- Dissocier colonies de cellules ES en supprimant les médias et en ajoutant 30 pi de trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine par addition de 170 ul de milieu cellulaire ES (tableau 1) et la pipette de haut en bas pour la dissociation complète de la colonie dans des cellules individuelles. Cultiver les cellules à 37 ° C / 5% de CO 2 jusqu'à ce que la plupart des puits sont plus de 70% de confluence (habituellement 2-3 jours).
- Vous pouvez également choisir des colonies de cellules ES individuels à partir de boîtes de 10 cm en utilisantun microscope inversé. Après aspiration de la colonie dans la pointe de pipette suivi l'étape 4.1.1 plaçant chaque colonie dans un puits d'une plaque à 96 puits, prétraitées avec de la gélatine et contenant 30 pi de trypsine.
Remarque: Les colonies peuvent siéger à la trypsine à TA pendant toute une rangée de colonies est capté. - Une fois que toutes les colonies ont été cueillies et dissociées dans les médias poussent les cellules à 37 ° C dans l'incubateur à CO 2 jusqu'à ce que la plupart des puits sont plus de 70% confluentes (généralement 2 jours).
- Lorsque les plaques à 96 puits sont prêts pour le fractionnement, retirez le support, ajouter 30 ul de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine en ajoutant 180 ul de milieu de cellules ES (tableau 1) à chaque puits et la pipette de haut en bas pour la dissociation complète en cellules individuelles.
- Du 210 pi résultant, ensemencer 70 pi en trois gélatine revêtu des plaques à 96 puits contenant chacun 130 pl d'ES médias de cellules / puits (tableau 1). Utilisez ces plaques pour genotyping, l'analyse d'expression et la congélation des stocks de cellules pour chaque clone comme décrit ci-dessous.
- Lorsque la plaque de génotypage atteint 70-85% de confluence, traiter la plaque comme décrit au chapitre 6 «génotypage la suppression".
- Lorsque la plaque d'analyse d'expression atteint 70-85% de confluence, retirez le support, sceller la plaque avec du ruban adhésif et un magasin d'étanchéité à -80 ° C jusqu'à ce que les clones ont été génotypés.
Remarque: La plaque d'analyse d'expression est utile pour analyser les changements dans l'expression génétique au début des passages des clones. Analyse de l'expression génique à partir de la plaque de 96 puits est possible, mais que le nombre de cellules est faible d'un kit de micro-extraction de l'ARN est recommandée. - Préparation du gel de 96 puits Plate Stock:
- Lorsque la plaque pour les stocks de cellules congelées (stock-1) atteint 70-85% de confluence, aspirez les médias, ajouter 30 ul de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 100 ul de milieu de cellules ES ( voir le tableau 1) to chaque puits et la pipette de haut en bas pour la dissociation complète en cellules individuelles.
- Transfert de 15 pi de cellules en suspension dans chaque puits à deux plaques à 96 puits de gélatine revêtues, chacune contenant 185 pi d'ES milieu cellulaire (tableau 1) et permettre de croître à 37 ° C / 5% de CO 2.
Note: Ceci est pour le stock-2 et -3 plaques qui sont des clones de back-up en cas supplémentaires ranimant les cellules du stock-1 ne réussit pas.
- Pendant ce temps, les 100 pi des cellules restantes de la plaque de 96 puits (actions 1), ajouter 100 ul de 2x gel médias (tableau 6). Sceller la plaque avec une bande d'étanchéité et rapidement inverser la plaque 4-5 fois pour un bon mélange. Conservez la plaque à -80 ° C jusqu'à ce que les clones sont génotypés.
- Lorsque les plaques de stock-2 et de stock-3 sont prêts pour la congélation Aspirer les médias, ajouter 30 ul de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine en ajoutant 70 ul de milieu de cellules ES (Tmesure 1) à chaque puits et la pipette de haut en bas pour la dissociation complète en cellules individuelles.
- Ajouter 100 ul de 2x médias congélation, sceller la plaque avec du ruban d'étanchéité et inverser rapidement la plaque 4-5 fois pour un bon mélange. Conservez la plaque à -80 ° C jusqu'à ce que ces plaques sont nécessaires.
Conception Primer 5. allèle spécifique
- Conception 4 ensembles d'amorces (figure 1C) à l' écran des clones pour la suppression souhaitée: à l' intérieur des amorces, des amorces externes et gARN flanquant amorces (pour les 5 'et 3' des sites cibles gARN) comme décrit ci - dessous.
- Obtenir la piste SNP correspondant aux 129 et Cast génotypes à http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. La piste donnée montre des substitutions de base entre 129 et Cast à des coordonnées dans l'ensemble du génome de la souris mm9.
Remarque: Le lien sur le site ci-dessus va rediriger vers le navigateur de génome UCSC et ajouter une piste personnalisée contenant le SNP entre le 129 et Cast genomes. - Entrer les coordonnées de la région à supprimer. Zoom sur une région d'environ 500 pb dans le milieu de la suppression souhaitée contenant> 3 SNP.
- Allez à voir> ADN dans la barre d'options et cliquez sur obtenir l'ADN pour télécharger la séquence cible dans tous les formats majuscules.
- Créer deux séquences FASTA; un pour 129 et un pour Moulage par substitution de base à la position SNP. Marquez les SNPs par un boîtier inférieur.
- Aller à Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) et collez le SNP substitué 129 séquence. Utilisez les paramètres par défaut pour concevoir des amorces.
- Pour concevoir les amorces spécifiques d'allèles intérieur sélectionner Primer_List dans le menu tâche de déposer et cliquez sur Choisir apprêts. Choisir une amorce avant ou arrière qui a un SNP soit en extrémité ou dans les 4 bases de l'extrémité 3 '3 et tombe à l'intérieur de la région à supprimer.
Note: Amorces qui ont un SNP à l'affichage de la spécificité de l'extrémité 3 'ont augmenté allèle qPCR. - Pour sélectionner le second retour d'amorce à la page principale, sélectionnez Détection dans le menu déroulant de la tâche et coller la première séquence d'amorce dans la case appropriée au bas de la page. Dans l'onglet Paramètres généraux modifier le réglage pour la gamme de taille de produit à 80-200 pb et cliquez sur Choisir apprêts. Choisissez un ensemble d'amorces des paires d'amorces énumérées; ce seront les 129 amorces spécifiques d'allèles à l'intérieur.
- Répétez les étapes 5.1.5 à 5.1.7 pour concevoir des amorces pour l'allèle Cast.
- Retour au navigateur de génome UCSC et entrez les coordonnées de la région à supprimer. Allez à voir> ADN dans la barre d'options, sous Options Sequence Retrieval Région ajouter 1000 pb en amont et en aval cliquez obtenir l'ADN pour télécharger la séquence cible.
- Marquer la séquence cible gARN entre parenthèses. Sauvegardez cette séquence entière avant de poursuivre.
- Pour concevoir les amorces externes éliminer la séquence entre les deux séquences cibles gARN. Répétez l'étape 5.1.4-5.1.8 pour concevoir l'extérieur amorce spécifique d'allèles mais changer la taille du produit 400-800 pb.
- Diviser la séquence obtenue à l'étape 05/01/10 en deux séquences, chacune ayant 500 paires de bases 5 'et 3' de la séquence cible gARN. Répétez les étapes 5.1.5 à 5.1.7 conception des amorces spécifiques non allèles pour les régions flanquant gARN mais changer la taille du produit 400-800 pb.
Remarque: Pour des amorces spécifiques non allèles, soit 129 ou la séquence Cast peut être utilisé et les amorces doivent être choisies qui ne contiennent pas un SNP. Il est conseillé de définir une taille de produit de 400-800 pb pour la conception de l'extérieur et gARN flanquant amorces. Cela permet une amplification, même si les petits indels sont présents.
- Obtenir la piste SNP correspondant aux 129 et Cast génotypes à http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. La piste donnée montre des substitutions de base entre 129 et Cast à des coordonnées dans l'ensemble du génome de la souris mm9.
- Testez les amorces à l'intérieur de la spécificité de l'allèle par qPCR utilisant de l'ADN génomique de la souche 129 et Cast pur à 2 ng / ul. Suivez l'étape 6,2-6,4 pour mettre en place la réaction qPCR.
Remarque: si le génotype 129 dans la région cible est identique à celle C57BL / 6J, l'ADN provenant C57BL / 6J peut être utilisé à la place de 129 l'ADN. amorces spécifiques d'allèles devraient afficher au moins 5 cyclesdifférence entre la valeur Ct (seuil de cycle) sur le bon par rapport au génotype incorrect. Les amorces externes peuvent être testés afin de s'assurer qu'ils amplifient la suppression à l'aide cas9 / ARNg transfecté les cellules ES et les commandes de l'ADN génomique de F1 respectivement positives et négatives. L'allèle-spécificité des amorces externes peuvent être testés une fois que les clones monoalléliques ont été identifiés.
6. génotypage la suppression
- Extraire l'ADN génomique à partir de l'analyse génotypique plaque à 96 puits en utilisant la plaque de l'étape 4.6 qui est généré après l'expansion de la colonie.
- Préparer la génomique extraction d'ADN mélange: 89 pi d'eau, 10 pi de 10x tampon et 1 pl de réactif d'extraction (fourni par le fabricant). Ajouter 100 pi de génomique extraction d'ADN mélange à chaque puits et sceller la plaque avec un ruban d'étanchéité.
- Incuber la plaque à 75 ° C pendant 5 minutes puis 95 ° C pendant 5 min.
- Laisser refroidir la plaque par incubation sur de la glace pendant quelques minutes und, puis centrifuger brièvement pour régler toute condensation au fond du puits. Cela sert de plaque d'ADN matrice pour le criblage de suppression.
- Mettre en place les réactions qPCR en double pour chaque clone comme suit: 5 pi de 2x SYBR qPCR mélange, vers l'avant et l'amorce (3 uM) chaque 1 pl et 1 pl d'eau inverse. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 2 ul d'ADN matrice, suivie de 8 pi de mélange réactionnel dans chaque puits d'une plaque à 384 puits.
- Sceller la plaque avec du ruban adhésif et de spin d'étanchéité à 600 g pendant 2 min pour mélanger le contenu. Placez la plaque de 384 puits tableau dans la vraie cycleur de temps.
- Programme réel cycleur de temps pour une PCR en deux étapes, suivie par une analyse de courbe de fusion avec la détection de la manière suivante: 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 62 ° C pendant 30 secondes avec la plaque de lecture et 95 ° C pendant 10 s, 65 ° C à 95 ° C avec un incrément de 5 ° C pendant 5 s + plaque de lecture.
Remarque: En plus de l'amorce conception, la qPCR miparamètres x et le cycle contribuent également à l'amorce de spécificité. Les paramètres décrits ci-dessus et des réactifs mentionnés dans les matériaux donnent plus souvent l'amplification allèle spécifique. - Analyse des résultats de qPCR
- Vérifiez chaque allèle pour l'amplification avec des amorces spécifiques d'allèles à l'intérieur. Aucune amplification d'un allèle ou des différences de valeur élevée Ct (> 5 cycles) entre allèles suggèrent que ces clones portent une délétion hétérozygote de l'allèle avec la valeur élevée / absent Ct. Aucune amplification des deux alleles suggère qu'ils portent une délétion homozygote.
- Vérifiez chaque allèle pour l'amplification avec l'extérieur amorces spécifiques d'allèles. Lorsque la suppression de la cible est supérieure à 1 kb amplification avec des amorces extérieures se produit uniquement quand une délétion est présente. Une valeur Ct de 22-28 confirme la suppression. Pour les suppressions de cibles plus petites que 1 kb, confirmer la taille de l'amplicon par électrophorèse.
Remarque: Si les amorces externes ne montrent que l' allèle spécificité modérée (voir Figure 2), les amplicons peuvent être obtenues avec les deux jeux d'amorces alléliques dans les clones monoalléliques en raison de l' amplification de cible des amorces extérieures. Dans ce cas, une différence de valeur Ct entre les deux allèles d'au moins cinq cycles doit confirmer l'allèle correcte (valeur de Ct plus faible) est supprimée sur la base des résultats obtenus à partir des amorces internes. Si la cible par rapport à l'allèle hors cible Ct différence est inférieure à cinq cycles concevoir de nouveaux allèle amorces externes spécifiques. - Dans clones de deletion monoalléliques vérifier l'intégrité de l'allèle non-supprimé en utilisant le criblage secondaire, gARN flanquant amorces.
Remarque: indels de> 25 taille de pb autour du site cible gARN peuvent être identifiés par l'observation d'un décalage de la courbe de fusion dans la qPCR pour 400-800 amplicons pb. En variante, les amplicons des amorces flanquant gARN peuvent être séquencés pour détecter de petites indels de <25 pb.- Effectuer qPCR avec 2 ensembles de gARN amorces flanquant -à- dire, 5 'et 3' gARN utilisé dans la génération de CRISPR suppression. Aucune amplification avec ces ensembles d'amorces indique indels plus grande que l'amplicon qPCR sont présents au niveau du site cible gARN sur l'allèle non délété de clones de deletion monoalléliques. clones Jeter contenant ces grandes indels de une analyse plus approfondie que les résultats peuvent être difficiles à interpréter sans connaître l'étendue de la suppression.
- Purifier les amplicons obtenus à partir de la réaction qPCR de l'amorce externe en utilisant une PCR nettoyer kit suivant les instructions du fabricant.
- Confirmer la séquence de l'allèle supprimé par séquençage d'ADN du produit de PCR purifié à partir de l'étape précédente. Utilisez les amorces d'amplification qPCR pour l'avant et le séquençage inverse.
Remarque: A ce stade SNP au sein de l'acte de amplicon comme une confirmation secondaire du génotype de l'allèle supprimé.
7. Analyse Expression avec allèles Amorces spécifiques
- Décongeler le 96 puits stock de cellules plate stockés à -80 ° C (Stock-1 de l'étape 4.9) en le plaçant sur un bain de perles chaud. Lorsque plus de la moitié des puits de la plaque sont décongelées, rotation à 300 xg pendant 5 min.
- Avec précaution, retirer la bande d'étanchéité et transférer rapidement les cellules de la suppression des puits positifs dans, plaques à 12 puits revêtues de gélatine contenant 1 ml de milieu de cellules ES (tableau 1) et incuber à 37 ° C / 5% de CO 2.
- Lorsque la plaque atteint 70-85% de confluence, le passage des cellules et les diviser en trois puits d'une plaque à 6 puits revêtues de gélatine, contenant chacun 2 ml de milieu de cellules ES (tableau 1). Utiliser deux puits pour préparer les 2 flacons de stocks de cellules congelées pour le stockage à long terme dans de l'azote liquide (décrit dans l'étape 8) et le troisième puits pour l'extraction de l'ARN.
- L'ARN extrait en utilisant un kit d'extraction d'ARN.
- Convertir 100-500 ng d'ARN en ADNc par transcription inverse (RT) de l'ARN en utilisant le kit de synthèse d'ADNc en suivant le protocole du fabricant. Inclure une RT negative réaction pour chaque échantillon d'ARN pour surveiller la quantité d'ADN contaminant dans les échantillons d'ARN.
- Diluer l'ADNc avant qPCR dans un rapport compris entre 1: 2 et 1: 4; en fonction du niveau du gène cible dans des cellules ES de l'expression.
- Réglez le qPCR comme décrit ci-dessus, y compris F1 ADN génomique comme courbe standard (5 dilutions de pliage de 250 à 0,08 ng / ul) pour la quantification absolue des niveaux de transcription. Comparer l'expression d'un allèle du gène d'intérêt dans chaque clone a confirmé supprimé à un gène de contrôle approprié, par exemple Gapdh (amorces énumérées dans le tableau 7).
Nota: Les amorces de gène de contrôle ne doivent pas nécessairement être allèle spécifique. la conception d'amorce allèle-spécifique est le même pour les amorces de RT-qPCR comme décrit pour les amorces de génotypage à l'exception de la région cible pour l'amplification. La séquence du gène doit être utilisé; si l'on utilise des amorces pour un seul exon ou une limite exon-intron (pour contrôler la transcription primaire) F1 ADN génomique peut être utilisé pourla courbe standard. Pour plus de détails sur RT-qPCR s'il vous plaît se référer à Forlenza et al. 2012 33.
8. Gel Stock Préparation pour le stockage à long terme de cellules ES
- Ajouter 300 pi de trypsine à chaque puits 6 (étape 7.3) et on incube pendant 5 minutes à 37 ° C. Ajouter 2 ml de milieu de spin (tableau 2) pour neutraliser la trypsine et de la pipette vers le haut et vers le bas plusieurs fois pour se dissocier dans des cellules individuelles.
- Transférer les cellules dans un tube de 15 ml et un essorage à 300 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de cellules ES (tableau 1). Pipeter vers le haut et vers le bas pour remettre en suspension les cellules.
- Transférer le contenu dans un tube cryofiole 1,5 ml et ajouter 500 pl de 2x congélation de cellules ES supports (tableau 3). Bien mélanger en inversant le tube et placer le tube dans un récipient de congélation de cellules sans alcool. Placez cette cellule de congélation des récipients à -80 ° C pendant au moins 12 heures avant la transferrineg dans un liquide de cuve de stockage d'azote.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le protocole décrit ici utilise des cellules ES F1 pour étudier cis - régulation de l' expression génique dans les cellules amplificatrices supprimé monoalléliques générés en utilisant CRISPR / cas9 édition du génome (Figure 1). Le gARN et la conception de l'amorce spécifique d'allèle pour le génotypage et l'expression génique sont les facteurs clés de cette approche. Chaque ensemble d'amorces spécifiques de l'allèle doit être validé par qPCR pour confirmer la spécificité de l'allèle. Des amorces spécifiques d' un allele qui amplifient seulement leur cible d'ADN génomique sont idéaux respectifs (figure 2). Idéalement, ces amorces ont un SNP à leur extrémité 3 '. Avec des amorces allèle moins une spécificité peuvent être utilisées si elles présentent au moins une différence de valeur Ct 5 dans leur amplification correcte par rapport au génotype 25 incorrect. Les amorces qui portent un SNP plus 5 'de la 4 ème base à partir de l'extrémité 3' ne parviennent généralement à présenter une spécificité allèle et amplifient les deux génotypes avec une efficacité égale,révélant l'importance de la position SNP dans l'amorce 34. En outre , une substitution purine / pyrimidine ou purine / pyrimidine a été montré pour avoir un impact plus important sur la différence de Tm de deux amorces par rapport à une substitution de la purine / pyrimidine 25.
le criblage primaire d'une plaque à 96 puits de l'ADN isolé à partir de clones de cellules ES est réalisée avec des amorces spécifiques d'allèle à l'intérieur pour identifier les clones qui portent une délétion d'un ou des deux allèles. Ces clones supprimés sont encore criblées avec l'extérieur des amorces spécifiques d'allèles pour confirmer chaque suppression. L'exemple donné ici est d'une paire gARN efficace qui a abouti à 46% des clones portant une délétion sur le 129, Cast, ou les deux allèles (figure 3). criblage secondaire est effectué pour confirmés clones de deletion monoalléliques pour identifier indels autour des sites cibles gARN sur l'allèle non supprimée lorsque la fréquence de indel se déclareraitrence sur le site cible gARN est élevé 23. Indels autour de l'ARNg ne sont pas identifiables dans le criblage primaire, étant donné que ces clones ne présentent pas de délétion avec des amorces à l' intérieur et n'amplifient avec les amorces externes (Figure 4). Les clones de deletion monoalléliques qui donnent une amplification avec les deux ensembles d'amorces flanquant gauche et droite gARN ont leurs autres allèle largement intact car ils ne contiennent pas de suppression supérieure à l'extrémité 5 'ou 3' qui flanquent gARN amplicons. Le séquençage des amplicons des amorces flanquant gARN identifiera indels plus petits que les amplicons flanquant gARN qui peuvent ne pas être perceptible dans la qPCR. Les clones de deletion monoalléliques qui ne donnent pas l'amplification dans les deux régions dans le criblage secondaire ne sont pas inclus pour une analyse de l'expression des gènes. Comme les régions cibles gARN sont choisis en dehors de la région suspectée d'avoir la fonction d'activateur, indels plus petits que les amplicons flanquant gARN ne sont pas susceptibles d'affecter la fonction d'activateur et de clones concontenant ceux-ci peuvent être inclus dans une analyse ultérieure.
Pour restreindre une grande deletion d'un allele d'un gARN peut être choisie qui chevauche un SNP dans la région de la graine ou de l'APM. Décrite ici est un exemple de suppression à haut rendement (53%) sur les 129 allèle en raison d'un SNP dans le PAM pour la 3 'gARN sur l'allèle Cast (Figure 5). Cette suppression a enlevé le SCR, un activateur spécifique Sox2 récemment décrit dans les cellules ES 18,22. Bien que l'introduction de la grande délétion a été considérablement réduite sur l'allèle Cast, trois clones (1, 11, 75) ont été identifiés avec une grande délétion sur l'allèle Cast (Figure 5). De ces trois clones deux (1, 11) contenait 3 'points de rupture au sein de 50 pb de la région 3' cible gARN. Pour le troisième clone nous ne sommes pas en mesure d'identifier le «point de rupture 3 et conclu que la suppression était supérieure à 11 kb 18. Des deletions avec une ou les deuxpoints de rupture de ir situés> 100 pb soit de 5 'de la région 3' de la cible gARN sont difficiles à génotype, généralement compte pour 15-30% de tous les clones, et restent non caractérisés dans le dépistage primaire que la suppression ne soit pas amplifié avec l'extérieur amorces.
Une fois que les clones ayant délétion monoallélique ont été identifiés, ils sont analysés pour l'expression génique spécifique d'allèle en utilisant une quantification absolue par transcription inverse qPCR. L' expression des gènes à partir des clones portant une deletion de la région monoallélique Sox2 activateur critique, le SCR est représenté ici par rapport à l' expression dans des cellules de type sauvage ES F1 (figure 6). En particulier, des clones portant une délétion de la région activatrice de l'allèle 129 ont montré une diminution de 129 niveaux de transcription alors que des clones portant une deletion à l'allèle Cast ont montré une diminution des niveaux de transcription Cast. Le gène analyse de l'expression spécifique à l'allèle révélé edans cette région activatrice distale, SCR, est un -regulator cis critique de Sox2 dans les cellules ES 18.
Figure 2. Test de l'allèle-spécificité des amorces spécifiques d'allèles 129 et Cast. (A) Amplification d'amorces pour le génotype 129. (B) Amplification d'amorces pour le génotype Cast. Dans les deux cas A et B, les lignes indiquent les profils d'amplification pour C57BL / 6 de l'ADN génomique qui a le même génotype que 129 l'ADN à ces SNP spécifiques; les lignes avec les milieux ouverts affichent les profils d'amplification de l'ADN génomique de Cast. Amplification résultant de l'ensemble d'amorces avec le plus allèle-spécificité est représenté en vert (allèle spécifique amorce-1), un ensemble d'amorces affichant une Ct différence 5 est montré dans (primaire-2 allèle spécifique) violet et un ensemble d'amorces affichage une différence minimale en valeur de Ct est represented en rouge (amorce 3 allele spécifique, les détails d'amorce dans le tableau 7). Le jeu d'amorces rouge ne serait pas approprié pour le dépistage spécifique d'allèle. RFU désigne des unités de fluorescence relative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Résultats obtenus après criblage d' une plaque de 96 puits avec des amorces à l' intérieur et à l' extérieur spécifiques d'allèles. (A) les résultats de qPCR de l'écran avec des amorces internes (Enh_del_IS_F1_129, Enh_del _IS_F1C, Enh_del _IS_R1) B) les résultats de qPCR de l'écran avec l' extérieur amorces (Enh_del_OS_F1, Enh del_OS_R1_129, Enh_del_OS_F2C, Enh_del_OS_R3, détails d'amorce dans le tableau 7). Dans les deux barres grises représentent l'amplification à partir d'amorces spécifiques Moulage et barres noires représentent l'amplification de prim 129 spécifique teurs. A noter que seuls les clones ayant une délétion sur un ou les deux allèles sont criblés avec les amorces externes. L'amplification relative de chaque allèle a été calculé en utilisant 2 -CT pour approcher la concentration initiale et ensuite exprimer chaque allèle en pourcentage de la somme des deux allèles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Les clones avec une délétion monoallélique sont criblés pour identifier les grands indels au niveau des sites cibles gARN. Amorces flanquant les régions cibles gARN sont utilisés pour confirmer que l'allèle non délété est intact. Seuls les clones monoalléliques sans grandes indels au niveau des sites cibles sur l'allèle non supprimés sont utilisés dans l'analyse de l'expression suivante. tp_upload / 53552 / 53552fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les clones obtenus à partir de la suppression Sox2 SCR. Montré sont les résultats de qPCR à partir d' un écran avec des amorces internes (pr111R, pr111F_129, pr111F_Cast, les détails dans le tableau 7). Les barres grises représentent l'amplification à partir d'amorces spécifiques Moulage et barres noires représentent l'amplification à partir d'amorces 129 spécifiques. Notez que la suppression est fortement biaisée vers l'allèle 129 en raison de la présence d'un SNP dans le PAM de la «région cible 3 gARN sur l'allèle Cast. L'amplification relative de chaque allèle a été calculé en utilisant 2 -CT pour approximer la concentration initiale et en exprimant ensuite chaque allele en pourcentage de la somme des deux allèles. fichiers / ftp_upload / 53552 / 53552fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. SCR suppression réduit considérablement l'expression de Sox2. Les résultats représentatifs de 129 ou Cast SCR supprimé clones. Les barres rouges représentent l' expression de l'allèle Sox2 Cast et barre bleue représente l' amplification de l'allèle Sox2 129. Suppression de la SCR sur la réduction de l' expression 129 allèle de Sox2 (129) , alors que la suppression de la SCR sur la réduction de l' expression de l' allèle de Cast Sox2 (Cast). Les données affichées sont une moyenne de trois répétitions techniques, les barres d'erreur non représentés. Amorces utilisées pour l' analyse d'expression Sox2 [Sox2_F, Sox2 (129) _R, Sox2 (Cast) _R] sont énumérés dans le tableau 7.pload / 53552 / 53552fig6large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Réactif | Concentration en Stock | Le volume | La concentration finale | ||||
| GlutaMAX | 200 mM | 6 ml | 2 mM | ||||
| 2-mercaptoéthanol | 10 mM, | 6 ml | 0,1 mM | ||||
| MEM acides aminés non essentiels (NEAA) | 10 mM, | 6 ml | 0,1 mM | ||||
| Pyruvate de sodium | 100 mM | 6 ml | 1 mM | ||||
| Pénicilline / streptomycine | 10.000 unités | 3 ml | 50 U / ml | ||||
| FBS | 90 ml | 15% | CHIR99021 * | 10 mM, | 3uM | ||
| PD0325901 * | 10 mM, | 1 pm | |||||
| FRV * | 10 7 unités / ml | 1000 U / ml | |||||
| # Pour préparer des milieux de cellules ES, ajouter les composants ci-dessus à 500 ml de DMEM élevé en glucose. Les médias de cellules ES ne doit pas être stocké pendant plus de 4 semaines et avec des inhibiteurs * pas plus de 2 semaines. | |||||||
Tableau 1. milieux cellulaires ES.
| Réactif | Concentration en Stock | Le volume | La concentration finale |
| GlutaMAX | 200 mM | 5 ml | 2 mM |
| Pénicilline / streptomycine | 10.000 unités | 5 ml | 100 U / ml |
| FBS | 50 ml | dix% | |
| # Pour préparer des milieux d'essorage, ajouter les composants ci-dessus à 500 ml de DMEM élevé en glucose. | |||
Tableau 2. médias Spin.
| Réactif | La concentration finale | Volume (50 ml) |
| 1x PBS sans Ca / Mg 2+ | 42,0 ml | |
| BSA Fraction V (7,5%) | 15% (v / v) | 7,5 ml |
| EDTA 0,5 M > | 5 mM | 0,5 ml |
Tableau 3. tampon de collecte.
| Réactif | La concentration finale | Volume (50 ml) |
| 1x HBSS | 47,25 ml | |
| 1M HEPES | 25 mM, | 1,25 ml |
| EDTA 0,5 M | 5 mM | 0,5 ml |
| BSA Fraction V (7,5%) | 1% (v / v) | 0,5 ml |
| FBS | 1% (v / v) | 0,5 ml |
Tableau 4. tampon de tri.
moyens ">Tableau 5. Moyens de récupération.
| médias de cellules ES | 60% |
| FBS | 20% |
| DMSO | 20% |
Tableau 6. 2x milieu de congélation.
Tableau 7. Liste des amorces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR / cas9 technologie d'édition du génome médiation fournit une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour la modification du génome. La méthode détaillée ici pour générer et analyser monoallélique suppression d'activateur pour la caractérisation fonctionnelle enhancer tire profit de SNP dans les cellules de souris F1. Les avantages de ce type d'approche sont: 1) les suppressions d'activateurs monoalléliques ne produisent pas des effets de confusion qui se produisent quand un activateur critique est supprimé de deux allèles, à savoir, une grande réduction des niveaux du gène régulé menant à la cellule de létalité de protéines ou modifié phénotype; 2) si la fréquence de suppression monoallélique est faible l'obtention d'un délétion homozygote est moins probable; Cependant, avec l'utilisation d'amorces spécifiques d'allèles dans l'analyse de l'expression génique, on peut analyser des clones avec une délétion monoallélique; 3) en utilisant quatre jeux d'amorces pour dépister les suppressions monoalléliques permet l'élimination des clones contenant des suppressions partielles ou grandes qui confondent laanalyse en aval.
la conception d'amorce allèle-spécifique est critique pour le génotypage mono / suppressions CRISPR bialléliques et analyse de l'effet sur l'expression génique d'une manière spécifique d'allèle. Ceci est plus facile à réaliser lorsque les cellules de F1 utilisées contiennent des SNP plus fréquentes qui permettent la discrimination des deux allèles. Ici ES cellules générées à partir d' un Mus musculus 129 x Mus croix de castaneus sont utilisés; Cependant, d'autres cellules peuvent être utilisées si les SNP entre les deux allèles permettent le dépistage de deletion et d'expression d'analyse spécifique d'allèle, et si des données suffisantes existent pour prédire les régions activatrices actifs afin de cibler dans le type cellulaire choisi. Par conséquent, cette méthode peut être adaptée à toute lignée cellulaire où les informations sur allélique SNP est disponible. Une des limitations du protocole est la dépendance à l'égard des SNP à des endroits précis. Certaines régions cibles portent moins SNPs ce qui rend la conception amorces externes spécifiques d'allèles qui amplifient un <800 pb fragment difficile. Dans de tels cas, une approche par PCR peut être utilisée comme alternative à la sélection qPCR permettant une plus grande amplicon. En outre, il peut y avoir des différences SNPs associés dans le phénotype des cellules ES F1; pour valider la fonction d'activateurs spécifiques dans les génotypes supplémentaires délétions homozygotes peuvent être réalisées dans des lignées ES standard. La spécificité de la nucléase SpCas9 est un problème important, en particulier dans l'examen des applications potentielles dans les approches cliniques. L' enquête sur la spécificité SpCas9 a révélé que tant la région de germes de 6 à 12 nt de la séquence de reconnaissance gARN et l'APM adjacents sont importants pour l' activité de nuclease 13-14,17. Mutations cibles Off peuvent être minimisés en veillant à ce que la région des semences et PAM adjacente sont uniques dans le génome en cours de modification 14,16.
Une approche de suppression monoallélique décrit ici couplé avec allèle spécifique ARN-seq peut définitivement révéler le gène ou gènes régulés par un e spécifiquenHancer 18. Ces expériences sont importantes pour la fonction compréhension du génome que la suppression du même journaliste-essai validé exhausteurs toujours ne pas affecter l' expression des gènes 18. De plus, les amplificateurs peuvent ne pas réguler le gène le plus proche dans le génome ou peut réguler plus d'un gène 1,20,35. Par conséquent, l'analyse de perte de fonction est l'approche la plus informative pour déterminer la fonction d'une région d'activateur. Ceci peut être réalisé rapidement en utilisant CRISPR / délétion monoallélique cas9-médiée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont lu les politiques de JoVE sur les conflits d'intérêts et ne pas avoir à divulguer les conflits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
References
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A.
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152 (2012).
- Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
- Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
- Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187 (2013).
- Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
- Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
- Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485 (2014).
- Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159 (2006).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
- Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
- Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
- Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
