Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
Histondeacetylase 1 en 2 (HDAC1,2) lokaliseren op de plaatsen van DNA-replicatie. In het vorige onderzoek met behulp van een selectieve remmer en een genetisch knockdown systeem, toonden wij nieuwe functies HDAC1,2 in replicatievork progressie en ontluikende chromatine onderhoud in zoogdiercellen. Daarnaast gebruikten we een BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek die chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van broom-deoxyuridine (BrdU) -gemerkte DNA combineert met slot blot en westerse analyses kwantitatief eiwitten of histonmodificatie geassocieerd met ontluikende DNA meten.
Actief delende cellen werden behandeld met HDAC1,2 selectieve remmer of getransfecteerd met siRNA tegen HDAC1 en HDAC2 en nieuw gesynthetiseerde DNA werd gemerkt met thymidine analoge broomdeoxyuridine (BrdU). De BrdU labeling werd uitgevoerd op een tijdstip waarop er geen significant celcyclus of apoptose door het verlies van HDAC1,2 functies. Volgende lAbeling van cellen met BrdU, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van histonacetylering merken of de chromatine-remodeler werd uitgevoerd met specifieke antilichamen. BrdU-gelabelde DNA ingang en immunogeprecipiteerd (of chiped) DNA werd vervolgens door aanstippen op een membraan met het slot blot-techniek en geïmmobiliseerd met UV. De hoeveelheid DNA in elke ontluikende slot werd vervolgens kwantitatief bepaald met behulp van Western-analyse met een anti-BrdU-antilichaam. Het effect van het verlies van HDAC1,2 functies op het niveau van nieuw gesynthetiseerde DNA-geassocieerde histonacetylering merken en chromatine remodeler werd vervolgens bepaald door het normaliseren van de BrdU-ChIP signaal afkomstig van behandelde monsters naar de controlemonsters.
Introduction
Defecte DNA herstel en / of DNA-replicatie zijn een belangrijke oorzaak van instabiliteit van het genoom, die celdood kunnen veroorzaken. Een enkele unrepaired double strand break voldoende is om celdood te 1 veroorzaken. Chromatine organisatie transient gewijzigd tijdens zowel de replicatie en reparatie 2,3 en niet epigenetische informatie behouden tijdens deze processen leidt tot een bedreiging voor de integriteit genoom. Verlies van HDAC3 of HDAC1,2 functie belemmert de S-fase progressie, DNA-replicatie en reparatie leidt tot genotoxische stress (DNA schade) en celdood 4-9. Daarom is een praktische strategie om selectieve HDAC inhibitoren replicatie, reparatie en chromatine verstoren kankercellen en DNA-schade veroorzaken, wat weer kan stoppen de groei en celdood selectief snel groeiende kankercellen.
Tijdens de DNA-replicatie, wordt chromatine snel gedemonteerd en daarna weer in elkaar gezet na DNA-duplicatie. Nieuw synthesized histon H4 wordt geacetyleerd op K5 en K12 residuen (H4K5K12ac) en na depositie op chromatine, zijn ze snel gedeacetyleerd door histondeacetylasen (HDAC) 10,11. Niet-cellen ontluikende chromatine integriteit van histondeacetylering handhaven kan leiden tot splitsing instorten, wat weer kan leiden tot DNA-schade en celdood. We hebben onlangs bleek dat de selectieve remming van HDAC1,2 verhoogt histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac en H4K16ac) en remt SMARCA5 chromatine remodeler activiteit op ontluikende chromatine, die correleert met verminderde progressie replicatievork, verhoogde vork instorting en verhoogde replicatie stress-geïnduceerde DNA-schade 6 . Aldus kunnen HDAC remmer ontluikende chromatinestructuur te veranderen op DNA-schade en de dood veroorzaken zeer snel in kankercellen, omdat deze cellen snel cyclus en langs vele malen via de S-fase. Daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe HDACs functie om histonacetylering en eiwitten bindi regulerenng DNA replicatie in zoogdiercellen te handhaven.
Om kwantitatief de hoeveelheid histonacetylering en SMARCA5 chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA tijdens de DNA-replicatie te meten, hebben we bedacht een aangepaste chip test genaamd de BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek. Na chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van een gewenst proteïne of histonmodificatie de hoeveelheid ontluikende DNA (geëtiketteerd met thymidine analoog BrdU) in het ChIP monster kan worden gedetecteerd met Western analyse van BrdU gelabelde ChIP DNA overgebracht op een membraan met behulp van een Groef Blot apparaat. Met deze techniek hebben we aangetoond dat H4K16ac (een markering die deze chromatine verpakking) en ISWI familielid SMARCA5 (SWI / SNF gerelateerde matrix geassocieerde actine afhankelijke regulator van chromatine) chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA in S-fasecellen 6. We vonden ook dat de ontluikende H4K16ac merk wordt gedeacetyleerd door HDAC1,2 tijdens de DNA-replicatie 6. H4K16ac remtchromatine remodeler activiteit van het ISWI familielid SMARCA5 12. Vandaar dat het gebruik van de BrdU-CHIP-Slot-Westerse techniek konden we de functies voor HDAC1,2 bij het reguleren van chromatine remodeling tijdens de DNA-replicatie te sluiten. Vandaar dat de BrdU-ChIP-Slot-Western Blot techniek is een krachtige aanpak van de associatie en dissociatie dynamiek van eiwitten of hun post-translationele modificaties die zijn gebonden aan ontluikende DNA kwantitatief te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit manuscript beschreven protocol is een relatief snelle methode om de aanwezigheid van eiwitten of hun post-translationeel gemodificeerde vormen van nieuw gerepliceerd of ontluikende DNA tonen. Bovendien, deze techniek maakt het mogelijk een aan de vereniging-dissociatie kinetiek van een eiwit of zijn gemodificeerde vorm met ontluikende DNA meten. Deze techniek is een aanvulling op de elegante iPOND technologie 13. In de iPOND technologie, is nieuw gesynthetiseerde DNA gelabeld met ethyl deoxyuridine …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk in dit manuscript werd ondersteund door fondsen van Dept. of Radiation Oncology en Huntsman Cancer Institute en het National Institute of Health subsidie (R01-CA188520) naar SB. Ik dank Danielle Johnson en Steven Bennett in mijn lab voor het aantonen van het protocol en het uitleggen van de voordelen ervan. Ik ben dankbaar dat Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) voor kritische opmerkingen over het manuscript.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Riferimenti
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., & Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. 2010 (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., & Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. Cell. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., & Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S. et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., & Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S. et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S. et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P. et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., & Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
- Alabert, C., & Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
- Clapier, C. R., & Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M. et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
