포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
히스톤 데 아세틸 라제 1 및 2 (HDAC1,2)는 DNA 복제의 사이트 지역화. 이전 연구에서, 선택적 억제제 및 유전자 녹다운 시스템을 이용하여, 우리는 복제 포크 진행 및 포유 동물 세포의 초기 염색질 HDAC1,2 유지에 대한 새로운 기능을 보였다. 또한, 우리는 슬롯 오 점 브로 모 옥시 우리 딘 (BrdU의) 표지 된 DNA의 염색질 면역 침전 (칩)을 결합과 서양의 정량적 초기 DNA와 관련된 단백질 또는 히스톤 변형을 측정하는 분석 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용했다.
적극적으로 분열하는 세포는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료 또는 HDAC1과 Hdac2에 대한 siRNA를 형질 도입 한 후 새로 합성 된 DNA는 티미 딘 아날로그 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)으로 표시 하였다되었다. 유의 한 세포주기 정지 또는 세포 자멸사가 없을 때의 BrdU 라벨링 인해 HDAC1,2 기능 상실 시점에서 이루어졌다. 다음 LBrdU의 히스톤 아세틸 마크, 크로 마틴 면역 (칩) 또는 염색질 인부와 세포의 abeling 특정 항체로 하였다. BrdU의 표지 된 DNA 입력 및 면역 침전 (또는 ChIPed) DNA는 슬롯 블랏 기술을 이용하여 막에 발견하고 UV를 이용하여 고정화시켰다. 각각의 슬롯에있는 초기 DNA의 양을 정량적으로는 항 BrdU의 항체로 웨스턴 분석을 사용하여 평가 하였다. 새로 합성 된 DNA 관련 히스톤의 아세틸 마크 및 염색질 인부의 레벨에 HDAC1,2 기능의 손실 효과는 대조 시료에 처리 된 시료로부터 얻어진 BrdU의 칩 신호를 정규화하여 측정 하였다.
Introduction
결함 DNA 수리 및 / 또는 DNA 복제는 세포 사멸을 유발할 수 게놈 불안정성의 주요 원인이다. 단일 수리되지 않은 이중 가닥 나누기 세포 사멸 원인 1에 충분하다. 염색질 조직은 일시적으로 모두 복제시 변경 및 2,3를 복구하고, 이러한 프로세스 무결성 게놈에 위협을 초래할 것 중에 후생 유전 학적 정보를 유지하기 위해 실패한다. HDAC3 또는 HDAC1,2 기능의 손실 유전자 독성 스트레스 (DNA 손상) 및 세포 사멸 4-9로 이어지는 S 상 진행, DNA 복제 및 수리를 방해한다. 따라서, 암 세포에서 복제, 보수 및 염색질을 방해 차례로 성장을 중지하고 급속 성장하는 암세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 DNA 손상을 유발하도록 선택 HDAC 억제제를 사용하는 실제적인 전략이다.
DNA 복제 동안 염색질 빠르게 분해 한 다음 DNA 복제 다음 조립. 새로 SYnthesized 히스톤 H4는 염색질에 K5와 K12 잔류 물 (H4K5K12ac) 및 다음 증착에서 아세틸, 그들은 빠르게 히스톤 아세틸 라제 (HDACs) 10, 11에 의해 탈 아세틸된다. 히스톤 탈 아세틸 화하여 초기 염색질의 무결성을 유지하기 위해 세포의 실패는 결과적으로 DNA 손상 및 세포 사망을 초래할 수 포크 붕괴로 이어질 수 있습니다. 우리는 최근, HDAC1,2의 선택적 억제가 증가 히스톤 아세틸 화 (H4K5ac, H4K12ac 및 H4K16ac) 감소 된 복제 포크의 진행과 관련이 초기 염색질에 SMARCA5 염색질 인부 활성을 억제하는 것으로 나타났다 포크 붕괴를 증가 및 복제 스트레스에 의한 DNA 손상 (6)을 증가 . 그러므로, HDAC 억제제 치료 빠르게 이러한 세포주기로서, 암세포에서 매우 빠르게 DNA 손상 및 사망을 유발과 S 상을 통해 여러 번 통과하는 초기 염색질 구조를 변경할 수있다. 그것은 HDACs는 히스톤 아세틸 화 단백질 BINDI을 조절하는 기능을하는 방법을 이해하는 것이 중요하다NG는 포유 동물 세포에서 DNA 복제를 유지한다.
정량적으로 히스톤 아세틸 화와 DNA 복제시 초기 DNA와 관련된 SMARCA5 염색질 인부의 양을 측정하기 위해, 우리는 수정 된 칩 분석이 BrdU의 칩 슬롯 지방 기술이라고 고안했다. 슬롯을 이용하여 막에 원하는 단백질 또는 히스톤 변형 염색질 면역 침전 (칩) 다음, 초기 DNA의 양의 BrdU 표지 된 칩 DNA의 웨스턴 분석을 이용하여 검출 할 수있다 칩 샘플 (티미 딘 유사체의 BrdU를 사용하여 표지)를 전송 오 장치. 이 기술을 사용하여, 우리는 H4K16ac (염색질 포장에 관련된 표시) 및 ISWI의 가족 SMARCA5 (염색질의 SWI / SNF 관련 매트릭스 관련 굴지 의존 레귤레이터) 염색질 인부가 S 상 세포에서 초기 DNA와 연관되어 있음을 보여 주었다 6. 우리는 또한 초기 H4K16ac 표시가 DNA 복제 6시 HDAC1,2에 의해 탈 아세틸 것으로 나타났습니다. H4K16ac의 억제ISWI의 가족 SMARCA5 (12)의 크로 마틴 인부 활동. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여, 우리는 DNA 복제시 염색질 리모델링을 조절하는 HDAC1,2의 기능을 연결할 수 있습니다. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 – 서쪽 오점 기술은 정량적으로 초기 DNA에 결합되어 단백질 또는 번역 후 변형의 연결 및 분리 역학을 측정 할 수있는 강력한 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 기술 된 프로토콜은 새로 복제 또는 초기 DNA에 단백질 또는 번역 후 변형 된 형태의 존재를 입증하는 상대적으로 빠른 방법입니다. 또한,이 기술은 초기의 단백질 또는 DNA와의 수정 된 형태의 어소시에이션 해리 동력학을 측정하는 하나를 허용한다. 이 기술은 우아한 iPOND 기술 (13)에 상보 적이다. iPOND 기술에서, 새로 합성 된 DNA는 에틸 옥시 우리 딘 (EDU)으로 표시됩니다. 비오틴…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고의 작업은 방사선 종양학 교실과 사냥꾼 암 연구소 (SB)에 보건 부여의 국립 연구소 (R01-CA188520)에서 기금에 의해 지원되었다. 나는 프로토콜을 입증하고 그 혜택을 설명하기위한 나의 실험실에서 다니엘 존슨과 스티븐 베넷 감사합니다. 나는 원고에 중요한 의견 박사 마헤 Chandrasekharan (헌 츠맨 암 연구소)에 감사드립니다.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Riferimenti
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