Examen des protéines liées à Nascent ADN dans les cellules de mammifères utilisant la technique BrdU-Chip-Slot-Ouest
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
Les histones désacétylases 1 et 2 (HDAC1,2) localisent sur les sites de réplication de l'ADN. Dans l'étude précédente, en utilisant un inhibiteur sélectif et un système de knock-down génétique, nous avons montré de nouvelles fonctions pour HDAC1,2 dans la réplication et la progression de la fourche naissant maintien de la chromatine dans les cellules de mammifères. En outre, nous avons utilisé une technique BrdU-Chip-Slot-Ouest qui combine immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de bromo-désoxyuridine (BrdU) l'ADN marqué au avec slot blot et analyse Western de mesurer quantitativement les protéines ou la modification des histones associées à l'ADN naissant.
Activement les cellules en division ont été traités avec HDAC1,2 inhibiteur sélectif ou transfectées avec des ARNsi contre HDAC1 et HDAC2 puis l'ADN nouvellement synthétisé a été marqué avec la bromodésoxyuridine thymidine analogique (BrdU). Le marquage BrdU a été fait à un point de temps où il n'y avait pas l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose significative en raison de la perte des fonctions HDAC1,2. Après lAbeling de cellules avec BrdU, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des marques d'acétylation des histones ou de la chromatine Remodeler a été réalisée avec des anticorps spécifiques. ADN d'entrée BrdU marqué et l'immunoprécipité (ou Pucée) a ensuite été repéré ADN sur une membrane en utilisant la technique slot blot et immobilisées en utilisant UV. La quantité d'ADN naissant dans chaque fente a ensuite été évaluée en utilisant l'analyse quantitative de Western avec un anticorps anti-BrdU. L'effet de la perte de fonctions HDAC1,2 sur les niveaux de l'histone marques d'acétylation nouvellement synthétisées ADN-associé et chromatine Remodeler a ensuite été déterminé en normalisant le signal BrdU puce obtenue à partir des échantillons traités à des échantillons de contrôle.
Introduction
Réparation de l'ADN défectueux et / ou la réplication de l'ADN sont une cause majeure de l'instabilité du génome, ce qui peut déclencher la mort cellulaire. Un seul non réparés double rupture des brins est suffisante pour causer la mort de la cellule 1. Organisation de la chromatine est transitoirement modifié au cours de la réplication et la réparation 2,3, et l'incapacité à maintenir l'information épigénétique au cours de ces processus se traduira par une menace pour l'intégrité du génome. Perte de HDAC3 ou la fonction HDAC1,2 entrave la progression de la phase S, la réplication de l'ADN et de réparation qui entraîne un stress génotoxique (dommages à l'ADN) et la mort cellulaire 4-9. Il est donc une stratégie pratique d'utiliser des inhibiteurs sélectifs de HDAC à perturber la replication, la réparation et la chromatine dans les cellules cancéreuses et provoquer des dommages à l'ADN, ce qui peut stopper la croissance et induire une mort cellulaire sélective dans les cellules cancéreuses à croissance rapide.
Lors de la réplication de l'ADN, la chromatine est rapidement démontés puis rassemblé suivante duplication de l'ADN. Nouvellement synthesized l'histone H4 est acétylée au K5 et K12 (résidus H4K5K12ac) et les dépôts suivants sur la chromatine, ils sont rapidement déacétylés par des histone désacétylases (HDAC) 10,11. Échec de cellules de maintenir l'intégrité de la chromatine naissante par désacétylation des histones peut conduire à l'effondrement de fourche, qui à son tour peut entraîner des lésions de l'ADN et la mort cellulaire. Nous avons récemment montré que l'inhibition sélective de HDAC1,2 augmente l'acétylation des histones (H4K5ac, H4K12ac et H4K16ac) et inhibe SMARCA5 activité chromatine Remodeler sur la chromatine naissante, qui est en corrélation avec réduite la progression des fourches de replication, l'augmentation de l'effondrement fourchette et une réplication accrue induite par le stress dommages à l'ADN 6 . Ainsi, le traitement de l'inhibiteur de HDAC peut modifier la structure chromatinienne naissant pour déclencher dommages à l'ADN et de mort très rapidement dans les cellules cancéreuses, car elles cycle de cellules rapidement et passer plusieurs fois à travers la phase S. Il est donc important de comprendre comment fonctionnent les HDAC de réglementer l'acétylation des histones et des protéines binding pour maintenir replication de l'ADN dans des cellules mammaliennes.
Pour mesurer quantitativement la quantité de l'acétylation des histones et SMARCA5 remodeler la chromatine associée à ADN naissant lors de la réplication de l'ADN, nous avons conçu un test de ChIP modifié la technique dite BrdU-Chip-Slot-Ouest. Suite à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) d'une modification de protéine ou histone on le souhaite, la quantité d'ADN naissant (marqué en utilisant analogue de la thymidine, la BrdU) dans l'échantillon de puce peut être détectée en utilisant une analyse Western de la puce ADN de BrdU marqué transféré sur une membrane en utilisant une fente Appareil Blot. En utilisant cette technique, nous avons montré que H4K16ac (une marque impliquée dans l'emballage de la chromatine) et le membre de la famille ISWI SMARCA5 (régulateur actine-dépendante matrice associée SWI / SNF-liés de la chromatine) remodeler la chromatine sont associés avec l'ADN naissante dans les cellules en phase S 6. Nous avons également constaté que la marque H4K16ac naissante est désacétylé par HDAC1,2 lors de la réplication de l'ADN 6. Inhibe H4K16acactivité de remodeler la chromatine du membre de la famille ISWI SMARCA5 12. Ainsi, en utilisant la technique BrdU-CHIP-Slot-Ouest, nous avons pu relier les fonctions pour HDAC1,2 dans la régulation de remodelage de la chromatine lors de la réplication de l'ADN. Par conséquent, la technique BrdU-Chip-Slot-Western Blot est une approche puissante pour mesurer quantitativement les association et de dissociation dynamique des protéines ou leurs modifications post-traductionnelles qui sont liés à l'ADN naissant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit dans ce manuscrit est une méthode relativement rapide pour démontrer la présence de protéines ou de leurs formes modifications post-traductionnelles sur l'ADN nouvellement répliqué ou naissant. En outre, cette technique permet à un pour mesurer les cinétiques association-dissociation d'une protéine ou sa forme modifiée avec de l'ADN naissant. Cette technique est complémentaire à l'élégant technologie iPOND 13. Dans la technologie iPOND, l'ADN nouvellement…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail dans ce manuscrit a été soutenu par des fonds provenant Département de radio-oncologie et Huntsman Cancer Institute et l'Institut national de la subvention de la santé (R01-CA188520) à SB. Je remercie Danielle Johnson et Steven Bennett dans mon laboratoire pour démontrer le protocole et expliquer ses avantages. Je suis reconnaissant envers le Dr Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) pour les commentaires critiques sur le manuscrit.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
Riferimenti
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