Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell'angiotensina II
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
Questo protocollo descrive recettore modelli vincolanti per angiotensina II (Ang II) nel cervello di ratto utilizzando un radiolegante specifico per i recettori Ang II per eseguire recettore mappatura autoradiografica.
campioni di tessuto sono raccolti e conservati a -80 ° C. Un criostato viene utilizzato per la sezione coronale del tessuto (cervello) e scongelare-montare le sezioni su vetrini cariche. Le sezioni di tessuto di diapositive montate sono incubati in 125 I-SI-Ang II radiomarcato recettori Ang II. Diapositive adiacenti sono separati in due gruppi: (NSP) in presenza di un recettore saturare concentrazione di non-radiomarcata Ang II, o un 'binding non specifico' AT 1 Ang II sottotipo recettoriale (AT 1 R) antagonista selettivo del recettore Ang II , e 'totale vincolante' senza AT 1 R antagonista. Una concentrazione di saturazione di AT 2 Ang II sottotipo recettoriale (AT 2 R) antagonista (PD123319, 10 micron) è presente anche nel incubatisul buffer di limitare 125 I-SI-Ang legame alla AT 1 R sottotipo II. Nel corso di un 30 minuti di pre-incubazione a ~ 22 ° C, scivoli NSP sono esposti a 10 micron PD123319 e losartan, mentre 'totale vincolante' diapositive sono esposti a 10 micron PD123319. I vetrini vengono poi incubate con 125 I-SI-Ang II in presenza di PD123319 per 'legame totale', e PD123319 e losartan per NSP nel tampone di dosaggio, seguita da diversi lavaggi '' nel buffer e acqua per eliminare il sale e non specificamente, legato radioligand. Le diapositive sono asciugati con blow-essiccatori, poi esposti a pellicola autoradiografia utilizzando una pellicola specializzato e cassetta. Il film è stato sviluppato e le immagini vengono scansionati in un computer per densitometria visiva e quantitativa utilizzando un sistema di imaging di proprietà e un foglio di calcolo. Un ulteriore insieme di diapositive sono thionin-macchiato per i confronti istologici.
Il vantaggio di utilizzare autoradiografia del recettore è la capacità di visualizzareAng II recettori in situ, all'interno di una sezione di un campione di tessuto, e anatomicamente identificare la regione di tessuto confrontandolo con una sezione di riferimento istologica adiacente.
Introduction
Le malattie cardiovascolari continua ad essere la principale causa di morte e disabilità negli Stati Uniti, causando più del 30% dei decessi negli Stati Uniti nel 2011 1. Le più recenti statistiche dalla American Heart Association indicano che più di una persona su tre ha un o più tipi di malattie cardiovascolari. la ricerca cardiovascolare continua a fare passi avanti contro la comprensione di questa malattia, ma come le generazioni iniziano invecchiando è imperativo continuare questi sforzi. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo centrale nella regolazione del sistema cardiovascolare promuovendo innanzitutto aterosclerosi, infiammazione, vasocostrizione sistemica, e l'attivazione del sistema nervoso simpatico (Figura 1) 2-8.
La RAS è un sistema ormonale che si attiva quando le cellule del rene iuxtaglomerulari secernono renina nel sangue in risposta alla diminuzione della pressione arteriosa, aumento sympatstimolazione hetic, o diminuito il flusso di sodio dal macula densa. Renina metabolizza angiotensinogen (sintetizzata nel fegato) per formare angiotensina I (Ang I). Ang I è poi metabolizzato dal dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE), un ectoenzima sul lato luminale delle cellule endoteliali vascolari, principalmente nei polmoni e reni, per formare angiotensina II (Ang II), il principale effettore peptide della RAS. Ang II è in grado di attivare due sottotipi recettoriali; il recettore di tipo 1 (AT 1 R) e il recettore di tipo 2 (AT 2 R), sia che regolano il sistema cardiovascolare, mantenere l'omeostasi idro-elettrolitico e sono ormai considerati di influenzare le funzioni cognitive e malattie neurodegenerative processi 8,9. Un locale, RAS specifica del cervello è segnalato per sintetizzare in modo indipendente Ang II. Nel cervello, il angiotensinogen proteina precursore viene sintetizzato in astrociti 10 convertito Ang I da un enzima renina-like 3, eventualmente prorenin legato al recettore prorenin11, e successivamente convertito in Ang II enzima di conversione che è abbondantemente espresso sulla superficie extracellulare dei neuroni nel cervello 12. Questo intrabrain generato Ang II è l'agonista per il cervello AT 1 e AT 2 recettori che sono isolate da sangue-borne Ang II.
Mentre l'AT 1 R svolge un importante ruolo fisiologico, è meglio conosciuto per i suoi effetti patofisiologici in tutto il corpo, soprattutto a carico del sistema cardiovascolare e dei reni (Figura 2). Quando Ang II si lega al AT 1 R, provoca vasocostrizione; aumentando la resistenza al flusso sanguigno e aumentare la pressione sanguigna. Inoltre promuove la sintesi e la secrezione di aldosterone e vasopressina, che porta ad un aumento della ritenzione di sodio e acqua. Questi effetti possono anche indurre danno ischemico cerebrale e disturbi cognitivi ed è collegata al morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, e diabetes, oltre ad essere recentemente identificato incidere apprendimento e memoria 13-15. C'è un ciclo di feedback nel RAS dal fatto che 1 R sulle cellule iuxtaglomerulari nel rene inibisce la secrezione di renina. È interessante notare che la AT 2 R generalmente contro-regola l'azione di AT 1 R, causando vasodilatazione, crescita dei neuriti, la rigenerazione assonale, anti-proliferazione, e cerebroprotection tra molti altri 16-20. L'AT 2 R è stato inoltre individuato come obiettivo per l'anti-ipertensione e di recente, farmaci anti-cancro 21. Determinazione della localizzazione e densità dei recettori Ang II all'interno di vari tessuti e come essi sono influenzati da vari trattamenti e stati di malattia utilizzando quantitativa autoradiografia del recettore densitometrica aiuterà a scoprire il ruolo della RAS gioca a malattie specifiche.
Autoradiografia del recettore è stato usato per oltre 30 anni come un metodo efficace per indicare la presenza di angiotensina II recettori e gli altri componenti dei RAS nel cervello e altri tessuti del ratto, topo, cavia, cane e umana sotto una varietà di condizioni sperimentali 22-34. L'importanza di localizzare recettori Ang II nel cervello è che si può applicare neuroanatomia funzionale alle azioni di Ang II nel cervello, ad esempio, la presenza di AT 1 R nel nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) suggerisce una funzione di Ang II nel cervello per stimolare vasopressina, ossitocina o il rilascio della corticotropina releasing hormone (CRH), o l'attivazione del sistema nervoso simpatico. Pertanto, i farmaci che bloccano l'AT 1 R potrebbero diminuire alcuni di questi effetti PVN-mediati associati sull'attività delle RAS cerebrali. Lavori in corso suggeriscono che l'uso di AT 1 antagonisti R può diminuire disturbo post-traumatico da stress (PTSD) rilascio indotta di CRH e migliorare i sintomi di PTSD (Hurt et al., Inviato per la pubblicazione). PVN, subfornicaleorgano (SFO), e l'amigdala sono noti per la regolazione dell'omeostasi, l'appetito / la sete, il sonno, la memoria, le reazioni emotive, e sono le aree di destinazione di questo studio dimostrazione. Queste regioni sono stati esaminati attraverso la raccolta di sezioni coronali di cervello su vetrini da microscopio, e il trattamento delle sezioni con inibitori specifici insieme a un radiolegante specifica per i recettori Ang II. In questo studio, tutti i materiali e reagenti insieme con i fornitori suggeriti sono elencati, iodio-125 è stato utilizzato per radiomarcato un antagonista Ang II recettore, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), che è stato poi purificato come mono 125 I -SI Ang II usando metodi HPLC come descritto in precedenza 35. L'utilizzo di questa specifica elevata radiolegante attività consente la visualizzazione di aree di bassa, moderata e alta densità recettoriale dopo esposizione delle sezioni radiomarcati alla pellicola a raggi x. Per calibrare il film con standard pasta cerebrali contenenti quantità note di iodio-125, la quantità specificadel recettore Ang II vincolante in una zona può essere quantificato. In studi sperimentali, il recettore Ang II vincolante nel cervello dei soggetti sperimentali può essere paragonata a quella nel cervello dei soggetti di controllo. Questo può indicare se le azioni di Ang II sono alterati in risposta ad una condizione genetica, anomalia fenotipica, stato di malattia o trattamento farmacologico. Questa conoscenza può essere applicata allo sviluppo di terapie per il trattamento di malattie associate con disregolazione del RAS. Tecniche alternative che identificano il recettore siti di legame, ma con ridotta risoluzione anatomica, sono test che utilizzano preparazioni di membrane di tessuto derivati da omogenati di tessuti, che vengono incubate con radiolegante in un range di concentrazioni per valutare radioligand affinità di legame come la costante di dissociazione (K D vincolanti ) e massima capacità legante (B max) del tessuto di interesse.
Il protocollo qui descritto può essere suddiviso in 5 principali components: Preparazione del tessuto Sezioni per autoradiografia del recettore; Autoradiografia del recettore; Esposizione Film e sviluppo; Istologia; e densitometrica Image Analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto identifica la visualizzazione del 'totale' e 'non specifico' legame del radioligando in sezioni adiacenti di sezioni coronali di cervello di roditori precedentemente raccolti e conservati a -80 ° C, e può essere facilmente applicabile a virtualmente ogni tessuto che è anatomicamente risolto sottostrutture che presentano importi differenziali di recettori o siti di legame radioligando. Le procedure descritte all'interno del protocollo sono semplici e l'analisi è fondame…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
Riferimenti
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
- Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U., Ganong, W. F., Martini, L. . Frontiers in Neuroendocrinology. , 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
- Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W., Wang, D. H. . Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. , 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscienze. 226, 489-509 (2012).
